タンパク質ホモオリゴマー化を研究するための蛍光変動分光法

蛍光ゆらぎ分光法は、サンプル中のタンパク質のオリゴマー化状態を決定できます。

まず、蛍光標識タンパク質モノマー溶液を含むチャンバースライドを取ります。スライドを共焦点顕微鏡下に置きます。レーザービームをサンプルのごく一部(共焦点体積)に集中させて、タンパク質モノマーを励起します。

タンパク質分子は、ブラウン運動により共焦点体積の内外に拡散します。この動きにより蛍光強度が急激に変化し、時間の経過とともに蛍光強度が変動します。

二量体化剤(2つのタンパク質モノマーが結合して二量体を形成するのを助ける二価リガンド)を追加します。二量体化により、2つの蛍光標識が一緒になって単一の粒子を形成し、粒子あたりの蛍光強度、つまり分子の明るさが増加します。

二量体化による分子の明るさの増加は、2つの蛍光標識が共焦点体積に出入りするため、蛍光変動の振幅を増加させます。

二量体化剤を添加する前後の時間にわたる共焦点体積の画像を取得します。

共焦点画像内の個々のピクセルの明るさを計算し、時間の経過に伴う平均輝度曲線を取得します。

二量体化剤を添加すると、各粒子からの二重蛍光シグナルにより明るさが 2 倍に増加しますが、タンパク質分子の総数は同じままであり、二量体の形成を示しています。

マルチウェルプレートアレイをセットアップするには、まず、サイズ排除クロマトグラフィーに使用したのと同じバッファーに100ナノモル精製FKBP12の溶液を調製します。凝集体の形成を防ぐために、13,000 RPMの素早い回転で超音波処理および遠心分離します。

次に、100〜200マイクロリットルの希釈タンパク質をガラス底の8ウェル観察チャンバーにピペットで入れます。BB二量体を10、20、40、80、100、150、300、および500ナノモルの最終濃度に添加します。参考として、100ナノモルのmVenus単独の溶液を調製して、潜在的な凝集効果と沈殿効果を評価し、同じ取得設定でモノマーの輝度値を回復します。

デジタル検出器または十分に特性評価されたアナログ検出器を装備し、取得するすべてのピクセルに対して一定の滞留時間を維持できる光学走査型顕微鏡共焦点システムを使用できます。蛍光相関分光法用に設計されたカラー補正水浸対物レンズを選択してください。

次に、襟補正水浸の目的に水を一滴加えます。8ウェル観察室をステージに取り付けます。514ナノメートルのレーザーをオンにし、対物レンズの出口で20〜100ナノワットの出力に設定して、励起ビーム経路を設定します。1つのHyD検出器をオンにします。フォトンカウンティングが可能な検出器が望ましいです。発光ウィンドウを520〜560ナノメートルから選択します。

取得モードには、16 x 16ピクセルを使用します。

滞留時間は、フレーム時間がタンパク質の拡散よりも長く、ピクセル滞留時間が大幅に短くなるように設定します。これは、このデモンストレーションで使用したシステムの滞留時間を約13マイクロ秒に設定することに対応しました。

ピンホールを1つのエアリーユニットに設定すると、対応する約545ナノメートルの発光が得られます。xy時間取得モードを選択し、取得およびウェルごとに取得するフレーム数を選択します。次に、ピクセル サイズを約 120 ナノメートルに設定します。

システムにハイスループットモードが装備されている場合は、各ウェルの座標とウェルごとの取得数を導入してプロセスを自動化します。システムに灌流システムが装備されている場合は、BB溶液をロードし、5,000フレーム目の直後に灌流を開始するようにプログラムして、10,000枚の画像を取得しながら二量体化の速度論を評価します。

正しいウェルを選択し、ソリューションに焦点を当てます。次に、取得を開始し、結果の画像スタックをTIFF形式で保存します。