アフィニティー抽出による RNA-Binding Protein の単離のための RNA-Protein プルダウンアッセイ

RNA結合タンパク質、またはRBP(転写後調節因子)を単離するには、標的RBPによって認識される配列であるアデニル酸ウリジル酸に富む要素(ARE)を含む低分子RNAプローブの懸濁液を取ります。RNAプローブは、ビオチン誘導体であるデスチオビオチンで標識されています。

ビオチンに親和性を持つタンパク質であるストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを追加します。ビーズが沈降するのを防ぐために、攪拌下でインキュベートします。デスチオビオチン標識RNAはストレプトアビジンに結合し、ビーズ上のRNAを固定化します。

磁場の下で、ビーズはチューブの側面に集まります。上清を取り除きます。RBP-RNA結合に最適なpHを提供するバッファーにビーズを再懸濁します。

磁石にさらされると、ビーズがチューブの側面に集まります。上清を捨てます。ビーズを標的RBPを含む溶液に再懸濁し、攪拌下でインキュベートします。

標的RBPは、ARE配列を認識してRNAに結合するRNA認識モチーフを有し、ビーズ上に固定化されたRNA-タンパク質複合体を形成します。

磁場の下では、ビーズはタンパク質とRNAの相互作用を乱すことなく磁石に向かって移動します。上清を捨てます。ビーズをビオチンを含む溶出バッファーに再懸濁します。

ビオチンは、ストレプトアビジンに競合的に結合することにより、ビーズからデスチオビオチンを置換し、タンパク質-RNA複合体を溶出させます。

溶出液中の標的RBPの存在を評価して、タンパク質-RNA相互作用を確認します。

RNA 50ピコモルあたり50マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを予洗いします。ストレプトアビジン磁性ビーズでチューブを15秒間渦にします。素早くボルテックスした後、カットしたピペットチップを使用して、200マイクロリットルを清潔な1.5ミリリットルのセーフロックチューブに取り出します。次に、チューブを磁気スタンドに置き、ビーズがチューブの側面に集まるようにし、1分間待ちます。再懸濁液を取り除きます。

ビーズを洗浄するには、400マイクロリットルの0.1モル水酸化ナトリウム、0.05モルの塩化ナトリウム溶液でチューブを磁気スタンドから取り外し、静かに上下に数回ピペットで移動します。チューブを磁気スタンドに戻し、1分間待ってから、上清を回収します。

ビーズを200マイクロリットルの100ミリモル塩化ナトリウムで洗浄し、上清を取り除きます。200マイクロリットルの20ミリモルトリスを加えます。ピペッティングでビーズを再懸濁し、チューブを磁気スタンドに置きます。1分後、上清を取り除きます。次に、200マイクロリットルの1x RNAキャプチャーバッファーでチューブを磁気スタンドから取り出し、ストレプトアビジン-磁気ビーズを短時間ボルテックスして再懸

50マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを除去し、カットしたピペットチップを使用して各標識RNAチューブに追加します。チューブをローラー上で室温で30分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに1分間置いたら、上清を取り除きます。50マイクロリットルの20ミリモルトリスをビーズに加え、再懸濁します。次に、チューブを磁気スタンドに置きます。1分後、上清を取り除きます。

100マイクロリットルの1xタンパク質-RNA結合バッファーをビーズに加え、再懸濁します。次に、チューブを磁気スタンドに戻します。チューブをスタンドに1分間置いたら、上清を回収します。100マイクロリットルのマスターミックスBを加えます。上下に穏やかにピペッティングして再懸濁し、気泡を発生させないようにします。反応チューブをローラー上で摂氏4度で60分間インキュベートします。

洗浄と溶出のステップに進みます。チューブを磁気スタンドに入れます。フロースルーを回収し、新しいチューブに移します。100マイクロリットルの1X洗浄バッファーをビーズにピペットで移します。穏やかに再停留させてください。それらをスタンドに戻します。1分間待ってから、上清を捨てます。この手順を 2 回繰り返します。

磁気ビーズに40マイクロリットルの溶出バッファーを加えます。上下にピペッティングして混合し、チューブシェーカーでインキュベートします。チューブを磁気スタンドに入れ、1分間待ってから、溶出液サンプルを採取します。氷の上に置き、下流の分析に使用します。