RNA-タンパク質相互作用を同定するためのSELEXベースのIn Vitro結合アッセイ

指数関数的濃縮によるリガンドの体系的な進化、SELEXは、タンパク質結合RNA配列の同定を可能にします。

まず、高度に特異的な構造に折りたたまれるランダム化された配列を持つ放射性標識RNAを含むランダム化RNAプールを取得します。標的タンパク質とインキュベートします。このタンパク質は、特定の配列と三次元構造を持つRNA分子に結合しますが、非特異的RNAは結合していないままです。

混合物をニトロセルロースフィルターに通します。結合していないRNAはフィルター細孔を通過しますが、RNA-タンパク質複合体は保持されたままです。

RNAタンパク質複合体を含むフィルターを断片に切り刻みます。標的タンパク質濃度を下げた状態でRNAプールをインキュベートすることにより、RNAとタンパク質の相互作用を繰り返すと、高親和性配列の結合のみが可能になり、低親和性配列は結合しません。

この混合物をポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動を行います。RNA-タンパク質複合体は、親和性の低い非結合RNAと比較して、ゲル内をゆっくりと移動します。X線ゲルイメージングは、RNA-タンパク質複合体の位置に対応するバンドシフトを示します。

複合体を含むゲル部分をスライスします。プロテイナーゼKをフィルターフラグメントとゲルスライスに添加し、タンパク質を消化し、複合体からRNAを放出します。フェノールクロロホルムを加えて遠心分離し、消化されたタンパク質からRNAを分離します。

RNA含有上清を酢酸ナトリウムおよびエタノールと混合します。RNAを沈殿させるための遠心分離機。RNaseフリーの水に再懸濁します。RNAを逆転写して相補的なDNAにし、DNAをPCR増幅します。

フィルターベースおよびゲルベースの分離を数回繰り返して、ターゲットタンパク質特異的DNA配列のプールを取得します。

とRNAを100マイクロリットルの反応量で結合するには、まず、50ミリモルの塩化カリウム、1ミリモルのDTT、0.09マイクログラム/マイクロリットルのウシ血清アルブミン、0.5単位のRNAsin、0.15マイクログラム/マイクロリットルのtRNA、および1ミリモルのEDTAを含む、pH 7.5で1ミリモルのトリス塩酸塩を調製します。次に、適切なプールから30マイクロリットルの組換えタンパク質PTBと10マイクロリットルのRNAを加えます。

結合反応の入ったチューブを温度ブロックに入れ、摂氏25度で約30分間置きます。次に、結合していないRNAから結合RNAを4回の選択と増幅を通じて分画します。まず、100マイクロリットルのサンプルを真空マニホールドに取り付けられたニトロセルロースフィルターを通して室温でろ過します。RNAタンパク質複合体はフィルターに残ります。

滅菌カミソリの刃でフィルターを断片に切り刻み、遠心分離管に挿入します。フィルター片をプロテイナーゼKバッファーに浸し、タンブラーの上に最低3時間または一晩置いてRNAを回収します。

RNAサンプルを脱タンパクするには、同量のフェノールクロロホルム、ボルテックスを加えます。その後、室温で5分間高速で遠心分離します。水相を取得し、再度クロロホルムで抽出します。その後、上清をpH 5.2の1/10体積の3モル酢酸ナトリウムと2〜3体積の無水エタノールと混合します。

チューブを摂氏-80度の冷凍庫に30分間放置し、高速で10分間遠心分離します。70%エタノールで洗浄と乾燥のステップを繰り返し、RNAをDEPC処理水に可溶化します。フィルター結合アッセイの最初のラウンドの後、さらに3ラウンドを実行します。

次に、転写、結合、増幅の2ラウンドを実行して、タンパク質結合RNA画分と非結合画分を分離します。アクリルアミドビスアクリルアミド比率が60:1のネイティブ5%ポリアクリルアミドゲルを0.5x TBEバッファーにプレキャストします。次に、RNA-タンパク質結合反応を設定します。

ゲルを摂氏4度の冷蔵室で0.5x TBEバッファーで満たされた電気泳動装置に入れます。250ボルトを15分間塗布し、結合反応を別のウェルにピペットで入れます。次に、さらに、電気泳動を250ボルトで1〜2時間実行することにより、結合していないRNAから結合RNAを分画する。

次に、ゲルをX線フィルムに露光し、オートラジオグラフィーを使用して結合したRNAの位置を特定します。結合したRNAでゲルスライスを切り取り、チューブに挿入します。ゲルスライスを粉砕し、プロテイナーゼKバッファー中で3時間または一晩インキュベートします。前述のように、フェノールクロロホルムとクロロホルムで抽出を繰り返します。溶解したRNAからcDNAを合成します。

2マイクロリットルの10x RTバッファー、2マイクロリットルのAMV逆転写酵素、1マイクロリットルの逆プライマー、5マイクロリットルの水、および10マイクロリットルの溶解RNAを含む20マイクロリットルの反応を調製します。摂氏42度で60分間インキュベートします。

前述のように、20〜25回のPCRサイクルを使用してcDNAを増幅します。RNA合成、タンパク質結合、タンパク質結合画分と非結合画分の分離のプロセスを繰り返します。