RNA-タンパク質相互作用を同定するためのSELEXベースのIn Vitro結合アッセイ

指数関数的濃縮によるリガンドの体系的な進化、SELEXは、タンパク質結合RNA配列の同定を可能にします。

まず、高度に特異的な構造に折りたたまれるランダム化された配列を持つ放射性標識RNAを含むランダム化RNAプールを取得します。標的タンパク質とインキュベートします。このタンパク質は、特定の配列と三次元構造を持つRNA分子に結合しますが、非特異的RNAは結合していないままです。

混合物をニトロセルロースフィルターに通します。結合していないRNAはフィルター細孔を通過しますが、RNA-タンパク質複合体は保持されたままです。

RNAタンパク質複合体を含むフィルターを断片に切り刻みます。標的タンパク質濃度を下げた状態でRNAプールをインキュベートすることにより、RNAとタンパク質の相互作用を繰り返すと、高親和性配列の結合のみが可能になり、低親和性配列は結合しません。

この混合物をポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動を行います。RNA-タンパク質複合体は、親和性の低い非結合RNAと比較して、ゲル内をゆっくりと移動します。X線ゲルイメージングは、RNA-タンパク質複合体の位置に対応するバンドシフトを示します。

複合体を含むゲル部分をスライスします。プロテイナーゼKをフィルターフラグメントとゲルスライスに添加し、タンパク質を消化し、複合体からRNAを放出します。フェノールクロロホルムを加えて遠心分離し、消化されたタンパク質からRNAを分離します。

RNA含有上清を酢酸ナトリウムおよびエタノールと混合します。RNAを沈殿させるための遠心分離機。RNaseフリーの水に再懸濁します。RNAを逆転写して相補的なDNAにし、DNAをPCR増幅します。

フィルターベースおよびゲルベースの分離を数回繰り返して、ターゲットタンパク質特異的DNA配列のプールを取得します。

タンパク質

とRNAを100マイクロリットルの反応量で結合するには、まず、50ミリモルの塩化カリウム、1ミリモルのDTT、0.09マイクログラム/マイクロリットルのウシ血清アルブミン、0.5単位のRNAsin、0.15マイクログラム/マイクロリットルのtRNA、および1ミリモルのEDTAを含む、pH 7.5で1ミリモルのトリス塩酸塩を調製します。次に、適切なプールから30マイクロリットルの組換えタンパク質PTBと10マイクロリットルのRNAを加えます。

結合反応の入ったチューブを温度ブロックに入れ、摂氏25度で約30分間置きます。次に、結合していないRNAから結合RNAを4回の選択と増幅を通じて分画します。まず、100マイクロリットルのサンプルを真空マニホールドに取り付けられたニトロセルロースフィルターを通して室温でろ過します。RNAタンパク質複合体はフィルターに残ります。

滅菌カミソリの刃でフィルターを断片に切り