DNAアプタマー-熱不安定性リガンド相互作用を研究するための示差走査熱量測定

示差走査熱量測定は、リガンドの存在下で生体分子を変性させるのに必要な熱を測定することにより、生体分子とリガンドの相互作用の研究に役立ちます。

まず、遊離DNAアプタマー(構造化一本鎖オリゴヌクレオチド)を含むリファレンスと、熱不安定なリガンド結合アプタマーを含むサンプルを取ります。リガンドはアプタマーの二次構造を安定させます。

溶液を加熱してフォワードスキャンを実行します。融解温度に達すると、遊離アプタマーは変性します。

リガンド安定化アプタマーはリガンドから解離し、比較的高い温度で変性し、遊離アプタマーと比較して溶融温度の上昇を引き起こします。高温では、リガンドのサブセットは、結合親和性の低い不可逆的な二次型を得る。

次に、アプタマー構造を取り戻すために溶液を冷却してリバーススキャンを実行します。より低い温度では、サンプル中の初期リガンドと変換されたリガンドがアプタマーに結合します。

2回目のフォワードスキャンでは、変換されたリガンドとの親和性が弱いアプタマーは、最初のリガンド結合アプタマーよりも低い温度で解離して変性し、融解温度のダウンシフトを引き起こします。

連続したスキャンにより、リガンドは二次型に変換され続け、その結果、初期型が完全に枯渇します。サーモグラムを入手します。

スキャンするたびに、リガンド結合アプタマーの融解温度は遊離アプタマーに向かってシフトし、二次型の結合親和性が弱いことを示しています。

示差走査熱量計(DSC)にロードする前に、卓上脱気装置で緩衝液、生体分子、およびリガンド溶液を脱気します。DSCから圧力ハンドルを緩めます。次に、作業バッファーからシリコンチューブを通し、基準キャピラリーのフロントフランジに取り付けます。

背面の基準フランジを前面のサンプル フランジに接続して、基準キャピラリとサンプル キャピラリーの間にブリッジを作成します。次に、真空ラインが取り付けられた廃フラスコにつながる背面サンプル フランジにシリコン チューブを取り付けます。真空ラインをオンにして、200ミリリットルの作業バッファーでDSCをフラッシュします。

まず

、シリコンチューブの約3〜5センチメートルのセクションを基準キャピラリーフランジに取り付けます。次に、1 ミリリットルのピペット チップをリア フランジのシリコン チューブに挿入します。ピペットで0.8ミリリットルの作業バッファーを引き出し、バッファー付きのピペットチップを前面基準フランジのシリコンチューブに挿入します。

ピペットプランジャーをそっと押し下げて、作業バッファーを前面のシリコンチューブを通して基準キャピラリーに通し、後部フランジの付属のピペットチップに通します。作業バッファーレベルが前面のシリコンチューブのすぐ上に達するまで、ピペットプランジャーを押し下げます。次に、作業バッファーレベルが背面のシリコンチューブのすぐ上に達するまで、ピペットプランジャーを放します。作業バッファーを基準キャピラリー内で前後に通過させ続け、気泡の量をパージします。

次に、背面のピペットチップを人差し指で覆い、背面のピペットチップと前面のピペットをそっと引き上げて、シリコンチューブが取り付けられた基準フランジから取り外します。サンプルキャピラリーに前と同じように作業バッファーをロードします。

背面基準フランジとサンプル フランジに黒いプラスチック キャップを置き、前面フランジを覆っていないままにします。圧力ハンドルをDSCに取り付け、DSCソフトウェアを開き、パワーの読み取り値が安定したら、インターフェイスの上部にある赤い「上」矢印をクリックして機器を加圧します。DSCパワーは、インタフェースの右上にあるボックスに、機器の温度と圧力の読み取り値とともに表示されます。

正方向および逆方向のスキャンを実行して、DSC を作業バッファーと平衡化します。画面左側の「実験方法」タブで、「スキャン」オプションが選択され、DSCを温度スキャンモードで実行します。

「実験方法」タブの「温度パラメータ」の挿入で、加熱ボタンをクリックします。実験温度の下限と上限には摂氏1度と100度、スキャン速度には摂氏1度/分、平衡期間には60秒を入力します。平衡期間の入力フィールドの下にある「系列を追加」ボタンをクリックします。ポップアップウィンドウの「追加手順」フィールドに2を入力し、「代替加熱/冷却」ボックスにチェックを入れます。「OK」をクリックします。

追加されたスキャンは、インターフェイスの下部に表示されます。各スキャンのパラメータが希望どおりであることを確認します。インターフェイスの上部にある緑色の「再生」ボタンをクリックして、実験を開始します。目的のウィンドウに移動し、ポップアップウィンドウに実験を保存するためのファイル名を入力します。「実験方法」タブの右側にある「データ」タブをクリックすると、実験の進行状況が表示されます。

両方の毛細管のワーキングバッファでDSCをリロードすることにより、サンプルデータのベースライン減算のための参照実験を実行します。120秒の上限平衡時間で、毎分1°Cの適切な温度範囲で複数の正方向および逆方向スキャンを収集します。

インターフェイスの下部から前のバッファ平衡化スキャンを削除するには、それぞれを個別に強調表示し、インターフェイスの右中央にある赤い「X」をクリックします。

「シリーズの追加」ボタンをクリックし、「追加する手順 」のフィールドに20を入力し、「代替加熱/冷却」ボックスにチェックを入れて、新しいスキャンを追加します。次に、「OK」をクリックし、先ほどと同じように緑色の「再生」ボタンをクリックして実験を実行します。

両方のキャピラリーに所望の濃度のリガンドを含む作業バッファーを使用してこれらの手順を繰り返し、リガンドの参照実験を取得します。熱不安定性リガンド変換の速度定数を取得するために使用する2つの別々の実験を収集します。

遊離生体分子データセットの場合、参照キャピラリーに作業バッファーが含まれ、サンプルキャピラリーに作業バッファー中に所望の濃度の遊離生体分子が含まれていることを確認します。次に、参照スキャンで使用したのと同じDSCローディング手順と実験パラメータを使用して、サンプル実験を実行します。

リガンド結合実験では、リガンドが参照キャピラリーの作業バッファーにあり、生体分子とリガンドがサンプルキャピラリーの作業バッファーにあることを確認します。以前と同様に、異なるリガンドの添加間でシステムをフラッシュします。

高温平衡期間を600秒に増やし、他のすべての実験パラメータは以前と同じである熱不安定性リガンドに結合した生体分子でさらに1回実験を行います。テキストプロトコルで説明されているように、データ処理と分析に進みます。