DNAアプタマー-熱不安定性リガンド相互作用を研究するための示差走査熱量測定

示差走査熱量測定は、リガンドの存在下で生体分子を変性させるのに必要な熱を測定することにより、生体分子とリガンドの相互作用の研究に役立ちます。

まず、遊離DNAアプタマー(構造化一本鎖オリゴヌクレオチド)を含むリファレンスと、熱不安定なリガンド結合アプタマーを含むサンプルを取ります。リガンドはアプタマーの二次構造を安定させます。

溶液を加熱してフォワードスキャンを実行します。融解温度に達すると、遊離アプタマーは変性します。

リガンド安定化アプタマーはリガンドから解離し、比較的高い温度で変性し、遊離アプタマーと比較して溶融温度の上昇を引き起こします。高温では、リガンドのサブセットは、結合親和性の低い不可逆的な二次型を得る。

次に、アプタマー構造を取り戻すために溶液を冷却してリバーススキャンを実行します。より低い温度では、サンプル中の初期リガンドと変換されたリガンドがアプタマーに結合します。

2回目のフォワードスキャンでは、変換されたリガンドとの親和性が弱いアプタマーは、最初のリガンド結合アプタマーよりも低い温度で解離して変性し、融解温度のダウンシフトを引き起こします。

連続したスキャンにより、リガンドは二次型に変換され続け、その結果、初期型が完全に枯渇します。サーモグラムを入手します。

スキャンするたびに、リガンド結合アプタマーの融解温度は遊離アプタマーに向かってシフトし、二次型の結合親和性が弱いことを示しています。

示差走査熱量計(DSC)にロードする前に、卓上脱気装置で緩衝液、生体分子、およびリガンド溶液を脱気します。DSCから圧力ハンドルを緩めます。次に、作業バッファーからシリコンチューブを通し、基準キャピラリーのフロントフランジに取り付けます。

背面の基準フランジを前面のサンプル フランジに接続して、基準キャピラリとサンプル キャピラリーの間にブリッジを作成します。次に、真空ラインが取り付けられた廃フラスコにつながる背面サンプル フランジにシリコン チューブを取り付けます。真空ラインをオンにして、200ミリリットルの作業バッファーでDSCをフラッシュします。

まず

、シリコンチューブの約3〜5センチメートルのセクションを基準キャピラリーフランジに取り付けます。次に、1 ミリリットルのピペット チップをリア フランジのシリコン チューブに挿入します。ピペットで0.8ミリリットルの作業バッファーを引き出し、バッファー付きのピペットチップを前面基準フランジのシリコンチューブに挿入します。

ピペットプランジャーをそっと押し下げて、作業バッファーを前面のシリコンチューブを通して基準キャピラリーに通し、後部フランジの付属のピペットチップに通します。作業バッファーレベルが前面のシリコンチューブのすぐ上に達するまで、ピペットプランジャーを押し下げます。次に、作業バッファー