ウイルス抗原に対する血清中の抗体アイソタイプを検出するためのウイルス抗原マイクロアレイアッセイ

準備したウイルス抗原マイクロアレイスライドでウイルス抗原マイクロアレイアッセイを開始します。

スライドには複数のパッドが含まれており、それぞれに複数のウイルス株の精製抗原がグリッド状に配置されたスポットに印刷された数百の精製抗原を含む単一のアレイがあります。各スポットには、3次元の微多孔質ニトロセルロース表面に吸着された単一の抗原タイプが含まれています。

スライドをチャンバーに固定して、後続のステップで簡単に取り扱うことができます。スライドの残りの表面に結合するタンパク質を含むブロッキングバッファーを追加して、表面への抗体の非特異的結合を防ぎます。

マイクロアレイスライドを希釈したヒト血清でインキュベートします。血清中の抗体アイソタイプは、スライド上の抗原に特異的で、抗原のエピトープを認識して結合します。

美容液を取り除きます。バッファーで洗浄して、スライド上の結合していない抗体とタンパク質を除去します。

量子ドット結合二次抗体混合物を、それぞれ異なる量子ドットで追加します。アイソタイプ特異的二次抗体は、スライド上の抗原に結合したそれぞれの血清抗体アイソタイプに特異的に結合します。

マイクロアレイイメージャーを使用して、マイクロアレイスライド内の抗原への抗体結合を定量します。

適切な波長で励起されると、二次抗体に結合した量子ドットは基底状態に戻り、光検出器によって検出される特定の蛍光シグナルを放出します。

スポット蛍光強度は、個々の抗原に結合した血清内の血清抗体アイソタイプを定量します。

印刷ソフトウェアを目的のプロトコルでプログラミングした後、印刷実行を開始します。完了したら、プローブされていないマイクロアレイスライドを室温でデシケーターキャビネット内の遮光ボックスに入れます。

マイクロアレイ上の抗体の血清をプローブするには、クリップを使用してマイクロアレイスライドパッド側を上にしてプロービングチャンバーに取り付け、チャンバーをフレームに配置します。

スライドは壊れやすいので組み立てるときは注意し、水分補給後は漏れがないか確認してください。必要に応じて、スライドを分解して再組み立てし、漏れを修正します。

ウェルあたり100マイクロリットルのろ過されたブロッキングバッファーでスライドを再水和し、サンプルあたり100マイクロリットルのブロッキングバッファーで血清を1〜100の比率で希釈します。次に、再水和したマイクロアレイスライドと希釈血清を室温で30分間、オービタルシェーカー上で毎分100〜250回転インキュベートします。

インキュベーションの最後に、二次収集フラスコを備えた真空ラインに接続されたピペットチップを使用して、パッドに触れずに各チャンバーの角からブロッキングバッファーを注意深く吸引し、パッドを乾燥させずに希釈した血清をすぐにパッドに加えます。次に、湿気を保つために密封された湿ったペーパータオルを入れたトレイに蓋をしたフレームを置き、ロッキングシェーカーでフレームを摂氏4度で一晩インキュベートします。

量子ドット結合二次抗体標識の場合は、先ほど示したように血清を慎重に吸引し、オービタルシェーカーでウェルあたり100マイクロリットルの新鮮なT-TBSバッファーで3回の洗浄でスライドを5分間すすぎます。次に、スライドを量子ドット結合二次抗体の混合物とともにインキュベートし、次に、先ほど示したのと同じ技術を使用して、プロトコルに記載されているように3回洗浄します。

最後の洗浄後、スライドをチャンバーから慎重に取り外し、ろ過した二重蒸留水でスライドを優しくすすぎ、各スライドを50ミリリットルのチューブに入れます。次に、スライドを遠心分離して乾燥させます。

マイクロアレイスライドの画像を取得するには、まずポータブルイメージャーの電源を入れ、イメージングチャンバー内のスライドホルダーに裏向きにして慎重に置きます。イメージングソフトウェアを開き、[イメージャーの構成]タブで、適切なスライド構成を選択します。

「イメージコントロール」タブで、適切な蛍光チャンネルを選択し、血清の反応性に応じて露光時間と取得時間を調整します。次に、「キャプチャ」をクリックして画像取得を開始します。取得の最後に、基準マーカーに向けられたグリッドを使用して、アレイスポットを検出します。