アクチンと微小管の結合ダイナミクスを可視化するTIRF顕微鏡法

アクチンモノマーは頭から尾まで重合して、マイクロフィラメントと呼ばれる細い繊維を形成します。同様に、チューブリン二量体は、より長い中空の円筒形微小管に重合します。これらの細胞骨格成分は、細胞の形状を維持し、細胞の運動を促進します。

全反射顕微鏡 (TIRF) によってアクチンと微小管の結合ダイナミクスを視覚化するには、カスタマイズされたイメージング アセンブリを使用します。

イメージングアセンブリは、上部のm-PEGシランコーティングされたカバーガラスと下部のビオチン-PEGシランコーティングされたカバーガラスの2つのカバーガラスで構成されています。2つのカバーガラスは両面粘着テープで縦方向に間隔をあけ、両端を密閉して流路を作ります。

BSAを流路にピペットで入れて、チャンバーをプライミングします。ストレプトアビジン溶液を加え、インキュベートします。ストレプトアビジン分子は、下部カバーガラスのPEG-シランに結合したビオチン分子に結合します。

TIRF バッファーをチャネルに流します。非標識および緑色蛍光色素標識チューブリン二量体、および非標識、ビオチン標識、および紫色蛍光色素タグ付きアクチンモノマーを含む細胞骨格混合溶液を追加します。

次に、ATP(アクチン重合促進剤)とGTP(チューブリン重合促進剤)、アクチン-微小管カップリングタンパク質を含む反応液を加えます。インキュベート。

チューブリン二量体はGTP分子に結合して重合し、アクチンモノマーはATP分子に結合して重合してそれぞれ微小管とマイクロフィラメントを形成します。

イメージングアセンブリをTIRF顕微鏡下に置きます。適切な波長のレーザーで蛍光色素を励起します。

励起光は内部で反射し、屈折率の異なる2つの媒体が存在するガラスと水の界面近くの限られた領域で蛍光色素を選択的に照らす光場を作成します。この領域では、マイクロフィラメントは紫色に見え、微小管は緑色に見えます。

両面両面テープを12枚24mmの長さにカットします。テープの裏地の片側を取り外し、きれいなイメージングチャンバーにある6つの溝に隣接するテープ片を固定します。テープの裏地の 2 番目の部分を取り外して、各チャンバーの溝に沿ってテープの粘着面を露出させ、チャンバーをテープ側を上にしてきれいな表面に置きます。

エポキシ樹脂と硬化剤溶液を小さな計量ボートで1対1で混合し、P1000チップを使用して、各イメージングチャンバーの溝の端にあるテープストリップの間に混合エポキシを一滴置きます。次に、チャンバーテープまたはエポキシ面を上にして、清潔な表面に置きます。

摂氏70度のインキュベーターからコーティングされたカバーガラスを取り出し、カバーガラスのコーティングされた表面とコーティングされていない表面を二重蒸留水で6回すすいでください。ろ過した窒素ガスで乾燥させ、カバーガラスコーティング面をテープに向けてイメージングチャンバーに貼り付けます。

P200またはP1000ピペットチップを使用してテープとガラスの界面に圧力を加え、テープとカバーガラスの間の密閉性を確保します。組み立てたチャンバーを室温で少なくとも5〜10分間インキュベートし、使用前にエポキシがチャンバー壁を完全に密閉できるようにします。

灌流室は、組み立てから12〜18時間以内に期限切れになります。灌流ポンプを使用し、50マイクロリットルの1%BSAを流してイメージングチャンバーをプライミングすることにより、灌流チャンバー内のコンディショニング溶液を順次交換します。

ルアーロックフィッティングリザーバーから余分なバッファーを取り除きます。次に、50マイクロリットルの0.005ミリグラム/ミリリットルのストレプトアビジンを流し、室温で1〜2分間インキュベートします。リザーバーから余分なバッファーを取り除きます。

50マイクロリットルの1%BSAを流して非特異的結合をブロックし、10〜30秒間インキュベートします。リザーバーから余分なバッファーを取り除きます。次に、50マイクロリットルの温かい1x TIRFバッファーを流し、次に50マイクロリットルの安定化および50%ビオチン化微小管シードを1x TIRFバッファーで希釈します。

最初の生化学反応をイメージングする前に、ステージまたは対物ヒーターデバイスを摂氏35〜37度の温度を30分間維持するように設定します。次に、取得間隔を 5 秒ごと、15 分から 20 分に設定します。次に、488および647レーザー露光を5%から10%の出力で50〜100ミリ秒に設定し、最初に重合反応を調整してアクチンフィラメントアセンブリを開始します。

647ナノメートルで画像を取得し、適切な調整を行います。次に、2番目の条件付き灌流ウェルで重合反応を調整して、微小管の組み立てを開始します。488ナノメートルで可視化し、適切な調整を行います。

3マイクロリットルの10マイクロモル488-チューブリンと7.2マイクロリットルの100マイクロモル蛍光非標識チューブリンの7.2マイクロリットルアリコートを、使用の15分以内に組み合わせます。次に、3マイクロリットルの希釈ビオチン化アクチンを、蛍光標識なしアクチンと標識アクチンの適切な量に組み合わせ、最終混合物が12.5マイクロモルの総アクチン、10%から30%の蛍光標識になるようにします。

ングの15分以内に、2マイクロリットルの12.5マイクロモルアクチン混合ストックとチューブリンストックミックスを組み合わせて、細胞骨格ミックスを調製します。使用するまで氷の上に保管してください。

2x TIRFバッファー、抗漂白剤、ヌクレオチド、バッファー、およびアクセサリタンパク質を含む、他のすべての実験成分とタンパク質を組み合わせて、タンパク質反応ミックスを調製します。細胞骨格ミックスをタンパク質反応ミックスで別々に、摂氏37度で30〜60秒間インキュベートします。

反応を開始するには、タンパク質反応混合物の内容物を細胞骨格ミックスに加え、混合します。15マイクロモルの遊離チューブリン、1ミリモルGTP、0.5マイクロモルのアクチンモノマー、および適切な量のバッファーコントロールを添加した1x TIRFバッファーを含む反応ミックス50マイクロリットルを灌流チャンバーに流します。

顕微鏡ソフトウェアを使用してタイムラプスムービーを記録し、5秒ごとに15〜20分間取得します。新しい灌流ウェルをコンディショニングし、バッファー容量を目的の調節タンパク質とバッファーコントロールに置き換えます。創発アクチン微小管機能の調節タンパク質を評価するために取得します。