アクチンと微小管の結合ダイナミクスを可視化するTIRF顕微鏡法

アクチンモノマーは頭から尾まで重合して、マイクロフィラメントと呼ばれる細い繊維を形成します。同様に、チューブリン二量体は、より長い中空の円筒形微小管に重合します。これらの細胞骨格成分は、細胞の形状を維持し、細胞の運動を促進します。

全反射顕微鏡 (TIRF) によってアクチンと微小管の結合ダイナミクスを視覚化するには、カスタマイズされたイメージング アセンブリを使用します。

イメージングアセンブリは、上部のm-PEGシランコーティングされたカバーガラスと下部のビオチン-PEGシランコーティングされたカバーガラスの2つのカバーガラスで構成されています。2つのカバーガラスは両面粘着テープで縦方向に間隔をあけ、両端を密閉して流路を作ります。

BSAを流路にピペットで入れて、チャンバーをプライミングします。ストレプトアビジン溶液を加え、インキュベートします。ストレプトアビジン分子は、下部カバーガラスのPEG-シランに結合したビオチン分子に結合します。

TIRF バッファーをチャネルに流します。非標識および緑色蛍光色素標識チューブリン二量体、および非標識、ビオチン標識、および紫色蛍光色素タグ付きアクチンモノマーを含む細胞骨格混合溶液を追加します。

次に、ATP(アクチン重合促進剤)とGTP(チューブリン重合促進剤)、アクチン-微小管カップリングタンパク質を含む反応液を加えます。インキュベート。

チューブリン二量体はGTP分子に結合して重合し、アクチンモノマーはATP分子に結合して重合してそれぞれ微小管とマイクロフィラメントを形成します。

イメージングアセンブリをTIRF顕微鏡下に置きます。適切な波長のレーザーで蛍光色素を励起します。

励起光は内部で反射し、屈折率の異なる2つの媒体が存在するガラスと水の界面近くの限られた領域で蛍光色素を選択的に照らす光場を作成します。この領域では、マイクロフィラメントは紫色に見え、微小管は緑色に見えます。

両面両面テープを12枚24mmの長さにカットします。テープの裏地の片側を取り外し、きれいなイメージングチャンバーにある6つの溝に隣接するテープ片を固定します。テープの裏地の 2 番目の部分を取り外して、各チャンバーの溝に沿ってテープの粘着面を露出させ、チャンバーをテープ側を上にしてきれいな表面に置きます。

エポキシ樹脂と硬化剤溶液を小さな計量ボートで1対1で混合し、P1000チップを使用して、各イメージングチャンバーの溝の端にあるテープストリップの間に混合エポキシを一滴置きます。次に、チャンバーテープまたはエポキシ面を上にして、清潔な表面に置きます。

摂氏70度のインキュベーターからコーティングされたカバーガラスを取り出し、カバーガラスのコーティングされた表面とコーティングされていない表面を二重蒸留水で6回すすいでください。ろ過した窒