生細胞における受容体-リガンド相互作用を可視化するための格子ライトシート顕微鏡法

格子ライトシート顕微鏡(LLSM)は、生細胞における細胞-受容体-リガンド相互作用を高い時空間分解能で可視化することができます。

赤色蛍光を発する形質導入されたリガンド発現細胞を含むカバーガラスを取ります。カバーガラスセルを上にして、グリースを塗ったサンプルホルダーに取り付けます。ホルダーを顕微鏡ステージのピエゾに固定すると、イメージング中に正確なサンプルの位置決めとスキャンが可能になります。ソフトウェア設定を調整して、単一のリガンド発現細胞に焦点を当てます。

受容体発現細胞懸濁液をカバーガラスにピペットで移動させます。受容体には、緑色の蛍光色素標識抗体がタグ付けされています。相互作用するセルペアを画像化します。

顕微鏡の励起レーザーは、円筒レンズを通過してライトシートを作成する円形の直線偏光レーザービームを放射します。ライトシートは変調器に投影され、余分な回折を除去し、超薄の格子パターンに変換します。

格子ライトシートは、相互作用するセルペアの極薄部分を照らし、相互作用するセルから発せられる蛍光は、入射ビームに対して垂直に捕捉されます。相互作用するセルペアを複数のZ平面で画像化し、高速度カメラで各焦点面で2次元画像をキャプチャします。

適切なソフトウェアを使用して、これらの画像を組み合わせて、細胞-表面受容体-リガンド相互作用の時空間ダイナミクスを示す高解像度の4次元画像であるzスタックを形成します。

10ミリリットルの水と30マイクロリットルのフルオレセインをLLSM浴に加えます。まず、画像(ホーム)を押してオブジェクトを画像位置に移動し、単一の容器レーザービームパターンを確認します。

ガイドとプリセットされた関心領域を使用してレーザービームを位置合わせし、ビームを全方向にバランスのとれた薄いパターンにします。ビームはファインダーカメラにも焦点が合っているように見えるはずです。2 つのミラー チルト アジャスター、トップ フォーカス マイクロメーター、対物レンズ カラーを使用してビームを調整します。

次に、浴槽と対物レンズを少なくとも200ミリリットルの水で洗浄し、フルオレセインを完全に除去します。

標準蛍光ビーズをイメージングするには、「X ガルボ範囲」ボックスで 3 に設定してディザをオンにし、ライブを押して現在のフィールドを表示します。チルトミラー、対物レンズカラー、フォーカスマイクロメーターを手動で調整して、最高のグレー値を得ることができます。次に、必要に応じて調整して、対物レンズスキャン、Zガルボ、Zプラス対物レンズ、およびサンプルスキャンキャプチャモードの適切なパターンを取得します。この後、サンプルスキャンモードで実行を押して、歪みや畳み込み解除のためのサンプルポイントスプレッド関数を収集します。レーザーを3色モードに変更し、もう一度実行を押します。

まず、準備した直径5ミリメートルの円形カバーガラスに100,000個の抗原提示細胞を加え、10分間沈降させます。サンプルホルダーにグリースを塗り、カバーガラスをセル側を上にして追加します。

次に、カバーガラスの裏側にイメージングメディアを一滴加えます。サンプルホルダーをピエゾにねじ込み、画像(ホーム)を押します。イメージングする抗原提示細胞を見つけ、LLSMとイメージングソフトウェアが適切に機能していることを確認します。

[ライブ] を押して、現在の画像を表示します。Zに沿って移動して、カバーガラスとセルを見つけます。Z方向に移動して抗原提示細胞の中心を見つけ、停止を押してレーザーを一時停止します。3Dにチェックを入れ、希望の設定を入力します。Enter キーを押してから Execute を押してデータを収集します。

ステージをロード位置まで下げ、50マイクロリットルのT細胞をイメージング培地に、カバーガラスの真上に滴下式に加えます。ピペットチップの端に液滴を形成してから、チップを浴液に触れるのが最善です。[画像]をクリックしてステージを元に戻します(戻ります)。

イメージングを開始します。希望のZスタックとタイムラプスの長さを必ず設定してください。たとえば、0.4マイクロメートルのステップサイズで60個のZスタックを画像化し、500番目の時間フレームを入力します。光退色を避けるために、500 フレームに達する前に録画を停止してください。ライブモードを使用してセルペアを検索し、準備ができて必要な設定を入力したら、実行を押してデータを収集します。