細胞膜上のナノロッドの拡散ダイナミクスを可視化するための暗視野顕微鏡法

暗視野顕微鏡を使用して生細胞膜上の金ナノロッド拡散ダイナミクスを調査するために、DFMは単一粒子追跡と組み合わせて、適切な培地を含む培養皿で滅菌されたカバーガラスから始めます。細胞懸濁液をカバーガラスに加えます。培地は細胞増殖を促進します。

電相互作用を介して負に帯電した細胞膜に吸着する正に帯電した金ナノロッドとインキュベートします。培地を皿からスライドガラスの溝までピペットで移動させます。カバーガラスセルを下にして溝に置き、密封します。

スライドを暗視野顕微鏡ステージに置きます。顕微鏡は、特殊な暗視野コンデンサーを通過する高角度斜めの光でサンプルを照らします。

ナノロッドが照射されると、ナノロッド表面の自由電子は入射光と共鳴する周波数で振動します。振動する電子は、対物レンズによって捉えられた特定の波長の光を散乱させ、ナノロッドの可視化を可能にします。

同様に、脂質とタンパク質で構成される細胞膜は、周囲の媒体よりも高い屈折率で入射光を散乱させ、暗い背景に対して明るい画像を作成します。時系列DFM画像をキャプチャします。

適切なソフトウェアを使用して、DFM画像に対して単一粒子追跡分析を実行し、細胞膜を通るナノロッドの拡散を高い時空間分解能で視覚化します。

エタノールを浸したガラスカバーガラスを炎で燃やし、フェノールレッドを含まない2ミリリットルの細胞培養培地を含む35 x 10ミリメートルの細胞培養皿にカバーガラスを置きます。50マイクロリットルの目的の細胞懸濁液をカバーガラスに加え、皿を前後左右に穏やかに振って細胞を均一に分散させます。

細胞が20%から40%のコンフルエントに達するまで、皿を細胞培養インキュベーターに約12時間入れてから、20マイクロリットルのCTABでコーティングされた金ナノロッドを皿に加えます。ナノロッドを皿全体に均一に分散させるために軽く振った後、皿を加湿雰囲気に5分間置きます。

インキュベーションの最後に、100マイクロリットルの上清を皿からスライドガラスの溝にゆっくりと移し、カバーガラスセル側を下にしてスライド溝に慎重に置きます。次に、カバーガラスの端をマニキュアで密封し、マニキュアを乾燥させてから、スライドを暗視野顕微鏡ステージに置きます。

暗視野顕微鏡による単一粒子追跡の場合は、油浸暗視野コンデンサーに油を一滴垂らし、コンデンサーがスライドガラスに接触するまでノブを回します。カバーガラスの上部にオイルを一滴垂らし、60倍のオイル浸漬対物レンズがオイルに触れるまでフォーカシングノブを回します。

光源をオンにし、フォーカスノブを少し回して、撮像面の焦点を合わせます。次に、顕微鏡ソフトウェアのカメラアイコンをクリックして、カラーCMOSカメラを使用してサンプル散乱光画像の時系列を記録し、画像をTIFF形式で保存します。

1 つの長期軌道を抽出するには、ImageJ で画像を開き、[画像] | [タイプ] | [8 ビット] の順にクリックして、画像を RGB モードから 8 ビット モードに変換します。コントラストを調整するには、[画像] | [調整] | [明るさ] | [コントラスト] の順にクリックし、パラメーターを設定します。ターゲットのパーティクルを選択し、「Control + X」を使用して時系列の背景を切り取ります。

プラグイン & パーティクル トラッカー クラシック | パーティクル トラッカー をクリックして、パーティクル検出とパーティクル リンク ウィンドウを開き、半径を 6、カットオフを 0、パーセンタイルを 0.01% に設定します。リンク範囲を10に、ディスプレイスメントを10に設定し、「OK」をクリックしてパーティクルトラッカーの結果ウィンドウを開き、結果を確認します。

「すべての軌跡を可視化」をクリックして、生成された軌跡を調べます。ソフトウェアで生成された軌道と金ナノロッドの移動軌道が一致する場合は、「フルレポートを保存」をクリックして結果を保存します。ソフトウェアで生成された軌道が金ナノロッドの移動軌道と一致しない場合は、「粒子の再リンク」をクリックして、検出された粒子を異なるリンク範囲とパーセンタイルパラメータで再リンクします。