ヌクレオソームダイナミクスを捉える高速タイムラプス原子間力顕微鏡

ヌクレオソーム(真核生物のDNA反復単位)は、ヒストンタンパク質コアに巻き付けられたDNAセグメントで構成されています。ヒストンコアの周りのDNAが解きほぐすことは、ヌクレオソームのダイナミクスにとって重要です。

ヌクレオソームのダイナミクスを捉えるには、原子間力顕微鏡、AFM、スキャナーステージに取り付けられた滑らかで機能化されたマイカ基板から始めます。基質をヌクレオソーム含有バッファーで重ねます。

負に帯電したヌクレオソームDNAは、官能化した雲母の正電荷と相互作用し、表面に固定化します。ヌクレオソームの過密化を防ぐために、固定化された雲母基質を緩衝液で洗浄します。

ヌクレオソームを含むスキャナーステージを、先端を端に置き、ヌクレオソームに向かって上を向く、事前に取り付けられたカンチレバーを含むイメージングチャンバーに移します。

チャンバーにイメージングバッファーを入れます。レーザービームをカンチレバーの背面に合わせて、正確なたわみ測定を保証します。

AFMチップは、完全に包まれたヌクレオソームの近くで振動し、表面をスキャンしてヌクレオソームの高さを一定の間隔で測定します。

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発的なDNAの包み解きは、ヌクレオソームの高さを増加させ、先端の振動を交互に起こし、カンチレバーのたわみにつながります。この片持ち梁のたわみにより、反射されたレーザービームの位置がシフトし、位置に敏感な検出器によって検出され、トポグラフィーヌクレオソーム画像が生成されます。

AFM画像では、ヒストンコアは、時間の経過とともに高さが増加する包み外されたDNAを持つ光る塊として現れ、ヌクレオソームのダイナミクスを示しています。

ガラスロッドスキャナー接着剤を使用して、ガラスロッドをAFMスキャナーステージに取り付けます。これを最低10分間乾燥させます。その間に、直径1.5ミリメートルの厚さ0.1ミリメートルの円形の雲母を、大きな雲母シートから打ち抜いて作ります。高速AFMマイカガラス棒接着剤を使用して、このマイカ片を高速AFMのガラス棒に貼り付け、乾燥するまで最低10分間は手つかずのままにします。

次に、テープ上によく切断された層が見えるまで、感圧テープを使用して雲母から層を切断します。次に、1マイクロリットルの50ミリモルAPSストックを99マイクロリットルの蒸留脱イオン水で希釈して、500マイクロモルのAPS溶液を作ります。切断したばかりの雲母表面に2.5マイクロリットルの溶液を堆積させ、表面を30分間機能化させます。

インキュベーション後、3マイクロリットルのすすぎを適用して、蒸留脱イオン水で雲母を数回すすぎます。すすぎのたびに、マイカの端に不織布ワイプを置き、水を完全に取り除きます。最後のすすぎ後、3マイクロリットルの蒸留脱イオン水を表面に置き、最低5分間放置して、非特異的に結