ヒト骨格筋におけるグリコーゲン分布を定量化するための透過型電子顕微鏡

分岐グルコースポリマーであるグリコーゲンは、ヒトの骨格筋内の細胞内筋原線維間、筋原線維内、および筋膜下コンパートメントにおけるエネルギー貯蔵です。

透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して細胞内グリコーゲンの分布を定量化するために、単離されたヒト骨格筋組織を取得します。組織構造を維持するためにグルタルアルデヒドで固定します。四酸化オスミウムとフェロシアン化カリウム溶液に組織を接着します。

還元されたオスミウム-フェロシアン化物複合体は、グリコーゲンのヒドロキシル基に結合し、筋肉内のグリコーゲン粒子のコントラストを改善します。さらに、膜と筋小胞体(膜に結合した細胞小器官)が染色されます。

エタノール濃度を上げて組織を脱水します。樹脂に埋め込み、固体のブロックを形成します。縦方向に配向した筋線維を持つ極薄切片を取得します。TEMグリッドへの転写。

グリッドを酢酸ウラニル、重金属溶液に浸します。ウラニルイオンは負に帯電した脂質やタンパク質に結合し、電子密度を高めます。クエン酸鉛溶液で染色します。

鉛イオンはグリコーゲン粒子を含むオスミウム染色領域に結合し、コントラストを高めます。また、酢酸ウラニル反応領域に結合し、電子不透明度を高めます。

TEM イメージング中、電子ビームが組織を通過すると、グリコーゲンを含む染色された電子密度の高い領域がより多くの電子を散乱し、未染色領域が電子を透過します。

生成された高コントラストTEM画像では、グリコーゲン粒子ははっきりと暗く見えます。染色されていない領域は明るく見えるため、筋肉内の細胞内グリコーゲン分布の視覚化と定量化が容易になります。

筋肉生検または筋肉全体から小さな標本を分離し、最大直径は任意の方向に1ミリメートルで、断面よりも縦方向に長い。

冷たい一次固定液が入ったチューブに標本を入れます。摂氏5度で24時間保管してください。次に、検体を0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液で4回洗浄します。トランスファーピペットを使用して、使用済みのバッファーをチューブから取り出し、検体はそのままにして、新しいバッファーを追加します。検体を1%四酸化オスミウム、および1.5%フェロシアン化カリウムで0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液に摂氏4度で120分間ポストフィ

検体を室温の二重蒸留水で2回すすいでください。室温で段階的な一連のエタノールに浸すことによって脱水します。上記の体積比を使用して、室温でプロピレンオキシドと推定樹脂傾斜混合物を試料に浸透させます。

翌日、100%新鮮なエポシジック樹脂に試料を型に埋め込み、摂氏60度で48時間重合させます。

検体のブロックをウルトラミクロトームホルダーに取り付けます。カミソリの刃で表面のブロックをトリミングして、組織レベルに到達させます。サンプルの前にダイヤモンドナイフを取り付け、サンプル表面をナイフと平行に合わせます。

ダイヤモンドナイフで厚さ1マイクロメートルの半薄片を作成し、サンプルの向きを確認します。光学顕微鏡で観察するために、半薄い部分をトルイジンブルーで染色します。次に、ブロックをさらにトリミングして関心領域を減らし、適切な超薄型セクションを取得します。

2本目のダイヤモンドナイフで厚さ60〜70ナノメートルの超薄型切片を切断します。パーフェクトループを使用して、1穴の銅グリッドに1〜2つのセクションを収集します。切片を対比させるには、グリッドを酢酸ウラニル溶液に20分間浸漬し、グリッドを二重蒸留水で洗浄し、次にグリッドをクエン酸鉛に15分間浸し、グリッドを二重蒸留水で再洗浄します。

透過型電子顕微鏡、コンピューター、画像記録ソフトウェアの電源を入れます。デジタルスロースキャンCCDカメラと関連するイメージングソフトウェアでデジタル画像を記録します。顕微鏡ステージに複数の切片を持つグリッドを挿入した後、最初に低倍率でグリッドをスクリーニングして最高品質の切片を選択し、筋線維の方向を決定します。

次に、30,000倍以上の倍率で画像に焦点を合わせ、ビームをセクション内の周辺ファイバーの中心に置き、希望の倍率で1秒の露光時間で画像を記録します。画像がファイバーの長さと幅全体にランダムに分布していることを確認し、偏りのない結果を得るために体系的な順序で、6〜10本のファイバーが画像化されるまでイメージングを繰り返します。

画像を imageJ にインポートするには、[ファイル] をクリックし、続いて [開く] をクリックします。[分析]をクリックし、[スケールの設定]をクリックして、画像の元のサイズに一致するようにグローバルスケールを設定します。100%拡大するには、[画像]をクリックし、[ズーム]に移動して、[イン]をクリックします。

ツール]メニューの[直線]ツールを使用して、筋原線腔の画像ごとに1つのZディスクの厚さを測定し、6〜10本の繊維のそれぞれの平均Zディスクの厚さを計算します。セグメント化された線ツールを使用して、筋膜下領域のすぐ下に見える最も外側の筋原線維の長さを測定します。

グリッドを挿入するには、[分析] をクリックし、[ツール] を選択してから、[グリッド] を選択します。次に、ポイントあたりの面積を 32,400 平方ナノメートルに設定します。クロスが筋膜下グリコーゲンに当たる12枚の筋膜下画像で、利用可能な長さ内のヒット数を数えます。

[分析] をクリックしてグリッドを挿入し、[ツール]、[グリッド] の順に選択し、[ポイントあたりの面積] を 160,000 平方ナノメートルに設定します。12枚の筋原線維画像で、クロスが筋原線維内空間に当たるヒット数を数えます。

次に、グリッドを挿入するには、[分析]をクリックし、[ツール]を選択してから、[グリッド]を選択します。次に、ポイントあたりの面積を 3,600 平方ナノメートルに設定します。クロスが筋原線維内グリコーゲンに当たる12枚の筋原線維画像のヒット数を数えます。

[分析] をクリックしてグリッドを挿入し、[ツール]、[グリッド] の順に選択し、[ポイントあたりの面積] を 32,400 平方ナノメートルに設定します。クロスが筋原線維間グリコーゲンに当たる12枚の筋原線維画像のヒット数を数えます。

32,400平方ナノメートルのグリッドを使用してグリコーゲン粒子をランダムに選択し、左上の正方形から始めて、必要に応じて左に移動します。直線ツールを使用して、12枚の画像のそれぞれについて、各プールのランダムに選択された5つのグリコーゲン粒子の直径を測定し、ファイバーあたりプールあたり平均60個の粒子を取得します。