ヒト骨格筋におけるグリコーゲン分布を定量化するための透過型電子顕微鏡

分岐グルコースポリマーであるグリコーゲンは、ヒトの骨格筋内の細胞内筋原線維間、筋原線維内、および筋膜下コンパートメントにおけるエネルギー貯蔵です。

透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して細胞内グリコーゲンの分布を定量化するために、単離されたヒト骨格筋組織を取得します。組織構造を維持するためにグルタルアルデヒドで固定します。四酸化オスミウムとフェロシアン化カリウム溶液に組織を接着します。

還元されたオスミウム-フェロシアン化物複合体は、グリコーゲンのヒドロキシル基に結合し、筋肉内のグリコーゲン粒子のコントラストを改善します。さらに、膜と筋小胞体(膜に結合した細胞小器官)が染色されます。

エタノール濃度を上げて組織を脱水します。樹脂に埋め込み、固体のブロックを形成します。縦方向に配向した筋線維を持つ極薄切片を取得します。TEMグリッドへの転写。

グリッドを酢酸ウラニル、重金属溶液に浸します。ウラニルイオンは負に帯電した脂質やタンパク質に結合し、電子密度を高めます。クエン酸鉛溶液で染色します。

鉛イオンはグリコーゲン粒子を含むオスミウム染色領域に結合し、コントラストを高めます。また、酢酸ウラニル反応領域に結合し、電子不透明度を高めます。

TEM イメージング中、電子ビームが組織を通過すると、グリコーゲンを含む染色された電子密度の高い領域がより多くの電子を散乱し、未染色領域が電子を透過します。

生成された高コントラストTEM画像では、グリコーゲン粒子ははっきりと暗く見えます。染色されていない領域は明るく見えるため、筋肉内の細胞内グリコーゲン分布の視覚化と定量化が容易になります。

筋肉生検または筋肉全体から小さな標本を分離し、最大直径は任意の方向に1ミリメートルで、断面よりも縦方向に長い。

冷たい一次固定液が入ったチューブに標本を入れます。摂氏5度で24時間保管してください。次に、検体を0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液で4回洗浄します。トランスファーピペットを使用して、使用済みのバッファーをチューブから取り出し、検体はそのままにして、新しいバッファーを追加します。検体を1%四酸化オスミウム、および1.5%フェロシアン化カリウムで0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液に摂氏4度で120分間ポストフィ

ックスします。

検体を室温の二重蒸留水で2回すすいでください。室温で段階的な一連のエタノールに浸すことによって脱水します。上記の体積比を使用して、室温でプロピレンオキシドと推定樹脂傾斜混合物を試料に浸透させます。

翌日、100%新鮮なエポシジック樹脂に試料を型に埋め込み、摂氏60度で48時間重合させます。

検体のブロックをウルトラミクロトームホルダーに取り付けます。カミソリの刃で表面のブロックをトリミングして、組織レベルに到達させます。サンプルの前にダイヤモンドナイフを取