タンパク質中の複数のリン酸化を同定するための核磁気共鳴分光法

タンパク質の複数のリン酸化には、さまざまな位置、特にセリン残基とスレオニン残基でタンパク質にリン酸基を付加することが含まれます。

タンパク質内の複数のリン酸化を特定するには、窒素 15 で標識されたリン酸化タンパク質を含むチューブから始め、アミド水素をタンパク質内の他の水素と区別するのに役立ちます。

相対共鳴周波数を正確に測定するために、内部NMR参照化合物を追加します。混合物を核磁気共鳴(NMR)チューブに移します。チューブを回転する開口部に挿入し、NMR分光計に入れます。

酸塩の存在は、リン酸化されたセリンおよびスレオニン残基に電子引き抜き効果を示します。その結果、リン酸化残基のアミド水素は、他のアミド水素と比較して電子密度が低く、シールドが解除されているように見えます。

電子環境を持つアミド水素は、原子核の周囲に微動磁場が発生し、低エネルギー状態になります。

短い高周波パルスを印加して、水素原子核の電子環境に基づいて特定の共鳴周波数でより高いエネルギー状態に励起します。

弛緩中、原子核は吸収されたエネルギーを放出することによって低エネルギー状態に戻り、NMR信号を生成することが検出されます。

個々のアミド水素を表す2次元NMRスペクトルをプロットします。

酸化タンパク質のスペクトルを非リン酸化タンパク質のスペクトルと比較します。リン酸化タンパク質のNMRスペクトルにおける追加の共鳴の出現は、複数のリン酸化を確認します。

凍結乾燥した^15Nおよび^13C濃縮ERK-リン酸化タウ4ミリグラムを400マイクロリットルのNMRバッファーに可溶化します。NMR分光計の電界ブロッキング用に5%酸化重水素を追加し、内部NMR信号基準として1ミリモルTMSPを追加します。また、完全なプロテアーゼ阻害剤カクテルの40倍ストック溶液を10マイクロリットル加えます。

長い針付きの電子シリンジまたはパスツールピペットを使用して、サンプルを5ミリリットルのNMRチューブに移します。プランジャーを使用してNMRチューブを閉じます。プランジャーを動かして、プランジャーと液体の間に閉じ込められた気泡を取り除きます。

NMRチューブをスピナーに入れます。適切なゲージを使用してスピナー内の垂直位置を調整し、サンプル溶液の大部分がNMRコイル内に入るようにします。次に、磁石制御システムウィンドウの「リフト」をクリックして、NMR装置の気流を開始します。チューブ付きのスピナーをマグネットボアの上部の気流に慎重に配置し、気流を止めて、チューブをマグネット内のプローブヘッド内の所定の位置に降下させます。

サンプルを摂氏25度まで平衡させた後、コマンドラインに「atmm」と入力して、プローブヘッドの半自動チューニングとマッチングを実行し、電力伝達を最適化します。次に、磁石制御システムウィンドウの「ロック」をクリックして、分光器の磁界周波数ロックを作動させます。

コマンドラインに「topshim gui」と入力してシムウィンドウを開くことで、サンプルの位置での磁場の均一性を最適化するためのシミング手順を開始します。次に、シムウィンドウの「開始」をクリックします。残差 B ゼロ標準偏差をチェックして、シムが最適であることを確認します。

次に、陽子高周波パルスの長さ(マイクロ秒単位)であるP1パラメータを校正します。このパラメータは、陽子スピン磁化の90度回転を得るために必要です。水陽子の1次元スペクトルを使用して360度のパルスを目指します。

01パラメータを1次元スペクトルの陽子水周波数に設定して、周波数オフセットを調整します。最後に、コマンドラインに「zg」と入力して、1次元陽子スペクトルの取得を開始します。