ラマン分光法を用いた直接免疫測定法による特異的抗原検出法

、ラマンレポーター色素分子を金ナノ粒子でインキュベートし、レポーターがナノ粒子に結合させます。

標的抗原に特異的なPEG結合抗体であるポリエチレングリコールを追加します。抗体は、金-ジスルフィド結合を介してナノ粒子に共有結合します。チオール共役PEGを添加して、残りのナノ粒子部位をブロックし、ナノ粒子の凝集を防ぎ、ナノ粒子プローブを形成します。

イムノアッセイプレートウェルを標的抗原でコーティングします。タンパク質を含む溶液で残りのプレート部位をブロックします。ナノ粒子プローブを追加します。ウェル全体で連続プローブ希釈を実行します。プローブ内の抗体が抗原に結合し、複合体を形成するためにインキュベートします。

ラマン顕微鏡を使用して、プローブの光学応答を測定します。入射単色レーザーは、金ナノ粒子の表面電子を励起して振動を引き起こし、プローブ表面に高い局所電磁場を生成します。

入射ビームとラマンレポーターが相互作用し、電磁場の強化により、非弾性光の強化や波長や周波数の異なるラマン散乱を引き起こします。非弾性に放出されたラマン信号は、ラマンスペクトルを生成するために使用されます。

ラマンレポーターピークのスペクトル面積をプローブ濃度に対してプロットして、プローブ検出の下限を見つけ、抗原のより高感度な検出を容易にします。

ラマンプローブを調製するには、まず、1.5ミリリットルの金ナノ粒子とラマンレポーターを2つのバッチを、付属のテキストプロトコルで説明されているように決定された濃度で作成します。

これは、ラマンレポーターと金ナノ粒子溶液を組み合わせ、室温で30分以上結合させることによって行われます。次に、PEG化抗体溶液をレポーター結合金ナノ粒子溶液の1つに添加して、抗体と粒子の比率を200対1にします。このソリューションはテストサンプル用です。

別の微量遠心チューブで、PEG化抗原を他のレポーター結合金ナノ粒子溶液に、抗原と粒子の比率を200対1で加え、コントロールとして使用します。両方の溶液を室温で30分間インキュベートします。

次に、ナノ粒子表面の残りの部位をブロックします。これを達成するには、まず、HPLC水を使用して固体メトキシポリエチレングリコールチオールを200マイクロモルの濃度に溶解します。チオールが完全に溶解するまで溶液を渦にします。次に、チオール溶液をナノ粒子結合PEG抗体溶液に40,000対1の比率で添加し、溶液を室温で10分間インキュベートして、金ナノ粒子上の残りの部位がブロックされるようにします。

次に、上清が透明になるように低結合遠心分離管内で粒子を遠心分離することにより、官能化ラマンプローブを回収します。ピペッティングで上清を除去しますが、ナノ粒子を乱さないように注意してください。次に、ナノ粒子を1ミリリットルのPBSで再懸濁します。

約3マイクロリットルの溶液からUV-Visible測定を行い、これは線形関係であるため、既知の金ナノ粒子濃度の結果と比較することにより、金ナノ粒子濃度

ナノ粒子が十分にブロックされていない場合、粒子間の接着力によりナノ粒子が凝集し、試薬が誤った濃度で添加されたことを示唆します。通常、溶液は濃い赤色ですが、凝集すると灰色の色合いになります。

最終溶液が1ミリリットルあたり少なくとも1 x 10¹¹粒子になるように容量を調整し、イムノアッセイプレートの機能化に使用されるまで溶液を摂氏4度で保存します。これらのソリューションは 1 週間以内に使用してください。まず、ポリスチレンウェルを満たすのに十分な希釈抗原を準備します。次に、溶液をボルテックスし、すぐに溶液をプレートウェルに加えます。

抗原を室温で1時間プレートに結合させます。次に、溶液を捨て、ペーパータオルで覆われたテーブルトップにプレートを叩いて、余分な抗原溶液を取り除きます。TBSTをウェルに加えて表面を洗浄します。次に、溶液を再び捨て、ペーパータオルで覆われたテーブルトップにプレートを当てて洗浄液を取り除きます。

次に、プレートの各ウェルに70マイクロリットルのHSAブロッキング溶液を加え、プレートを室温で30分間インキュベートすることにより、プレート上の残りの結合部位をブロックして非特異的結合を防ぎます。次に、ブロッキング溶液を取り除き、前述のようにプレートをTBSTで3回すすいでください。最後のすすぎを外した後、プレートに蓋をして、さらに使用するまで摂氏4度で乾燥させて保管してください。

事前に調製したプローブナノ粒子140マイクロリットルを96ウェルプレートの最初の列に加え、最初の5列にテストナノ粒子を、最後の3列にコントロールナノ粒子を配置します。他のすべてのカラムに 70 マイクロリットルの PBS を追加します。

各カラムを 1 から 2 の連続希釈液で希釈します。最初の列から70マイクロリットルを取り、2番目の列と混合することから始めます。次に、2番目の列から70マイクロリットルを取り、3番目の列に追加します。プレートを少なくとも1時間インキュベートさせます。

次に、結合していないナノ粒子プローブを除去し、前述のようにTBSTでプレートを5回洗浄します。最終洗浄後、各ウェルに70マイクロリットルのPBSを加え、プレートをプレートシールで覆います。対照サンプルが透明であることを確認してください。非特異的結合が発生した場合、コントロールサンプルはテストサンプルと同様の色になります。

倒立ラマン顕微鏡を使用して、金ナノ粒子プローブがある井戸の表面に対物レンズの焦点を合わせます。井戸のラマンスペクトルを取得します。1800逆センチメートルから400逆センチメートルの範囲のスペクトルを収集し、ウェルごとにこれを繰り返します。最後に、付属のテキストプロトコルの最後のセクションの手順に従って、セットアップの感度を決定します。