ラマン分光法を用いた直接免疫測定法による特異的抗原検出法

まず

、ラマンレポーター色素分子を金ナノ粒子でインキュベートし、レポーターがナノ粒子に結合させます。

標的抗原に特異的なPEG結合抗体であるポリエチレングリコールを追加します。抗体は、金-ジスルフィド結合を介してナノ粒子に共有結合します。チオール共役PEGを添加して、残りのナノ粒子部位をブロックし、ナノ粒子の凝集を防ぎ、ナノ粒子プローブを形成します。

イムノアッセイプレートウェルを標的抗原でコーティングします。タンパク質を含む溶液で残りのプレート部位をブロックします。ナノ粒子プローブを追加します。ウェル全体で連続プローブ希釈を実行します。プローブ内の抗体が抗原に結合し、複合体を形成するためにインキュベートします。

ラマン顕微鏡を使用して、プローブの光学応答を測定します。入射単色レーザーは、金ナノ粒子の表面電子を励起して振動を引き起こし、プローブ表面に高い局所電磁場を生成します。

入射ビームとラマンレポーターが相互作用し、電磁場の強化により、非弾性光の強化や波長や周波数の異なるラマン散乱を引き起こします。非弾性に放出されたラマン信号は、ラマンスペクトルを生成するために使用されます。

ラマンレポーターピークのスペクトル面積をプローブ濃度に対してプロットして、プローブ検出の下限を見つけ、抗原のより高感度な検出を容易にします。

ラマンプローブを調製するには、まず、1.5ミリリットルの金ナノ粒子とラマンレポーターを2つのバッチを、付属のテキストプロトコルで説明されているように決定された濃度で作成します。

これは、ラマンレポーターと金ナノ粒子溶液を組み合わせ、室温で30分以上結合させることによって行われます。次に、PEG化抗体溶液をレポーター結合金ナノ粒子溶液の1つに添加して、抗体と粒子の比率を200対1にします。このソリューションはテストサンプル用です。

別の微量遠心チューブで、PEG化抗原を他のレポーター結合金ナノ粒子溶液に、抗原と粒子の比率を200対1で加え、コントロールとして使用します。両方の溶液を室温で30分間インキュベートします。

次に、ナノ粒子表面の残りの部位をブロックします。これを達成するには、まず、HPLC水を使用して固体メトキシポリエチレングリコールチオールを200マイクロモルの濃度に溶解します。チオールが完全に溶解するまで溶液を渦にします。次に、チオール溶液をナノ粒子結合PEG抗体溶液に40,000対1の比率で添加し、溶液を室温で10分間インキュベートして、金ナノ粒子上の残りの部位がブロックされるようにします。

次に、上清が透明になるように低結合遠心分離管内で粒子を遠心分離することにより、官能化ラマンプローブを回収します。ピペッティングで上清を除去しますが、ナノ粒子を乱さないように注意してください。次に、ナノ粒子を1ミリリットルのPBSで再懸濁します