Name: マイコプラズマの最適化されたPCRベースの検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 学ぶマイコプラズマPCR検出法の最適化された手順。細胞培養の汚染を高感度で検出し、サンプル調製からゲル電気泳動による結果評価までを解説。研究者が培養系の健全性を確保するのに役立つ。

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Sigma - Aldrich社によって資金を供給

1。マイコプラズマ検出<ol><li>細胞の培養上清を直接テストすることができるまたはサンプルは、後日使用する目的で作成できます。の準備をするために、後95℃で滅菌増幅管とインキュベートで上清の代わりに100μlのを使用して℃で5分間。一度これは、サンプルが最大1週間2〜8℃で保存することができます完了です。ちょうど前のペレットのサンプルの短時間の遠心（5秒）、任意の細胞破片を実行する。 </li><li> PCR用サンプルを準備するには、反応に必要なジャンプスタートTaq DNAポリメラーゼ/再水和バッファの総量を決定する。我々は、合計5つの反応を準備されます。五反応はTaqの2.5μlおよび再水和のバッファの114.5μl必要になります。これはサンプルの反応とポジティブコントロールのための補水のバッファの負の制御に加え、24.5μlあたりの水分補給のバッファの反応と22.5μlあたりTaqの一単位の最小値が含まれます。反応あたりのDNAポリメラーゼの1単位は、補水のバッファの適切な音量に追加する必要があります。これは、使用されるTaqポリメラーゼによって異なります。 </li><li>きれいなマイクロ遠心チューブにTaq DNAポリメラーゼの計算されたボリュームを配置し、補水のバッファの計算量で従ってください。 DNAポリメラーゼ/水分補給のバッファは、チューブをタッピングし穏やかに混合されるべきである。この混合物をボルテックスしてはいけません。 </li><li>ネガティブコントロールとサンプルを準備するには、キットに付属の透明な反応チューブを使用してください。キットに含まれている反応管は既にnuclueotides、プライマーと内部コントロールDNAが含まれています。前の手順で準備したジャンプスタートTaq DNAポリメラーゼ/膨潤バッファーミックス23μlを、ネガティブコントロールとサンプルチューブの各々に配置する必要があります。ネガティブコントロールするDNAフリー水を2μlを加え、サンプルチューブとラベルの各サンプル2μlを加える。チューブをフリックでコンテンツを混在させること。内容をボルテックスしてはいけません。 </li><li>準備するにはポジティブコントロールはキットに付属のピンクの反応チューブを使用してください。キットに含まれている反応管は既にnuclueotides、プライマーと内部コントロールDNAが含まれています。反応管およびラベルに、前の手順で準備した、ジャンプスタートTaq DNAポリメラーゼ/膨潤バッファーミックス25μlを添加する。チューブをフリックでコンテンツを混在させること。内容をボルテックスしてはいけません。 5分間室温でネガティブコントロール、ポジティブコントロールおよびサンプルチューブをインキュベートする。 </li><li> PCRの場所にするために、サンプルは、サーマルサイクラーに配置する必要があります。 JumpStartのTaqを使用する場合、アクティベーション手順は必須ではありません。サーマルサイクラーでの反応チューブを置きます。サイクルは次のように設定する必要があります：94℃30秒、55℃30秒と40秒72℃のためのC。これらのサイクルを40回実行されます。 </li><li> PCRのサイクルが完了したらサンプルをサーマルサイクラーからそれらを削除し、氷に入れて、4〜8 ° Cまで冷却する必要があります。試料が冷却されているとき、彼らは電気泳動用アガロースゲルにロードする必要があります。彼らはすでに反応管に存在する限りローディングゲルと染料は不要です。直接、別の車線に各PCRに8μlをロードする。 3.0センチメートル - 2.5の移行後に電気泳動を停止します。 </li></ol> 2。代表的な結果ネガティブコントロールは、約481 bpのバンドが表示されるはずです。これは、ビデオの先頭に表示されている電気泳動ゲル上でネガティブコントロールの列で見ることができます。 481 bpのネガティブコントロールのバンドがない場合は、ポリメラーゼの活性がsufficienttaqが使用されていないことを示す良い指標が十分に敏感ではなかったです。 マイコプラズマ陽性検体は、270の範囲でバンドを± 8塩基が表示されます。バンドは、高度に汚染されたサンプルの重いと軽く汚染されたサンプルのかすかになります。強度の変化は、ビデオの先頭に表示されている電気泳動ゲル上の正のサンプルの列で見ることができます。すべてのサンプルは、PCRが期待どおりに発生したことを示すために内部ネガティブコントロールが含まれています。それは高度に汚染された試料の内部統制が存在しないことを確認するのが普通です。 あなたのサンプルの負の範囲で正の範囲またはバンドのバンドがない場合、これはあなたのサンプルが阻害されていることを示す良い指標です。サンプルが禁止されている場合はPCRの阻害物質は、DNAの抽出を行うことにより除去することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3057/3057fig1.jpg"> 図1関連するアンプリコンのバンド：PCRによるマイコプラズマ検出の結果が表示されます。レーン2は、約481 bpのバンドが表示されるはず陰性コントロール、です。 481 bpのネガティブコントロールのバンドがない場合は、使用されるTaqポリメラーゼが十分に敏感ではなかったことを示す良い指標です。 6 - マイコプラズマ陽性サンプルは、レーン3に示すように270 + 8 bpの範囲でバンドが表示されます。バンドは、HEAになりますVY高度に汚染された試料（レーン6）と軽く汚染された試料（レーン4）のためのかすかなため。すべてのサンプルは、PCRが期待どおりに発生したことを示すために内部陰性コントロール（481 bp）を含んでいます。それは高度に汚染された試料の内部統制が存在しないことを確認するのが普通です。

<ol><li>Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+Sensitivity+of+Polymerase+Chain+Reaction+%28PCR%29+in+Comparison+with+Other+Methods+for+the+Detection+of+Mycoplasma+Contamination+in+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines.</a> Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).</li>
<li>Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+Cell+Culture+Enrichment+for+Improving+the+Sensitivity+of+Mycoplasma+Detection+Methods+Based+on+Nucleic+Acid+Amplification+Technology+%28NAT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).</li>
<li>Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+Testing+of+Cell+Substrates+and+Biologics%3A+Review+of+Alternative+Non-Microbiological+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2011).</li>
</ol>

著者は、この記事で使用される試薬やツールを生成するシグマアルドリッチの従業員です。

のでキットの極端な感度で、正しく実行時キットは、サンプルがマイコプラズマ汚染があるかどうかを示す正確な結果が得られるはずです。このキットは、JumpStart Taq DNAポリメラーゼの使用に最適化されています。他のtaqsはサンプルを準備する際に使用されることがありますが、481 bpの内部統制のバンドは、代替Taqの適切な感度を示すために存在している必要があります。それは、汚染のレベルに応じて様々な密度を示すために正のバンドは可能です。汚れが多い試料での内部統制のバンドの有無を観察することが可能です。汚染を防ぐためにサンプルを準備する際の注意と適切なテクニックを使用すると、適切なため非常に重要です。見張りマイコプラズマPCR検出キットを用いて検出。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>見張りマイコプラズマPCR検出キット</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> MP0035 </td><td> </td></tr><tr><td> JumpStartのTaq DNAポリメラーゼ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D9307 </td><td> </td></tr><tr><td> GenElute血液ゲノムDNAキット</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> MP0030 </td><td> </td></tr><tr><td>ヌンク増幅管</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T0447 </td><td> </td></tr></tbody></table>

マイコプラズマの最適化されたpcrベースの検出

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

汚染のない細胞株の維持は、細胞ベースの研究に不可欠です。最大の汚染物質の懸念の中でマイコプラズマ汚染です。マイコプラズマは、通常、汚染された細胞を殺すことはありませんが、彼らは検出することが困難であり、新陳代謝の変化を含む培養細胞、、上の様々な効果を引き起こす可能性増殖と染色体異常を遅らせた。一言で言えば、マイコプラズマ汚染がライフサイエンス研究のための正確なデータを提供することで、これらの細胞株の価値が損なわれます。 実験室におけるマイコプラズマ汚染の源は非常に完全に制御することが挑戦しています。特定のマイコプラズマ種が人間の皮膚に見られるように、彼らは貧しい無菌操作を介して導入することができます。さらに、彼らはそのようなウシ胎児血清などの汚染されたサプリメントから来ることができる、そして最も重要な他の汚染された細胞培養物から。一度マイコプラズマが文化を汚染、それはすぐに研究室の他の地域を汚染して広げることができます。良い無菌操作などの検査室の安全基準を厳守が鍵であり、マイコプラズマのためのルーチン検査は、非常にマイコプラズマ汚染の成功を制御することをお勧めします。 マイコプラズマのPCRベースの検出は、ルーチン細胞株の維持のための非常にポピュラーな方法となっている。 PCRベースの検出方法は非常に敏感であり、研究者は、それが微生物学的手法を用いて必要な時間と比較して検出されると、汚染を分離し、除去するために迅速に対応できるように迅速な結果を、提供することができます。見張りマイコプラズマPCR検出キットは、ウェルあたりわずか2ゲノムの検出限界で、高感度です。高度に特異的なJumpStartのTaq DNAポリメラーゼと独自のプライマー設計を活かし、偽陽性が大幅に削減されます。便利な8連チューブのフォーマット、dNTPでプレコートされたストリップ、および関連するプライマーは、細胞株の大規模なコレクションを、お客様のニーズを満たすために、スループットの向上に役立ちます。 キットの極端な感度を考えると、細心の注意を試料と試薬の不注意による汚染を防ぐために注意しなければなりません。我々は実証ステップバイステップのプロトコルは、信頼性の高いマイコプラズマ検出に必要な予防措置や慣行を強調しています。我々はまた、表示と典型的な結果とその解釈について説明します。私たちの目標は、目を光らせマイコプラズマPCR検出キットを用いて研究者の成功を確実にするためです。

見張りマイコプラズマPCR検出キットは、細胞培養と生物製剤由来の他の細胞培養で、マイコプラズマAcholeplasma、およびウレアプラズマ汚染の検出に最も感度のための選択の方法として確立されて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用しています。

マイコプラズマの最適化されたPCRベースの検出

コンタミネーションのない細胞株の維持は、細胞ベースの研究において不可欠です。最も懸念されるコンタミネーションの一つに、マイコプラズマ汚染があります。

本手順の全体的な目的は、マイコプラズマ汚染の検出に最適化されたLookoutマイコプラズマPCR検出キットの使用手順を視覚的に実演することです。まず、サンプルを95 °Cまで加熱し、目的のテンプレートをPCRに適さない状態にする可能性のあるDNA分子を不活化させます。次に、ヌクレオチド、プライマー、および内部コントロールDNAがあらかじめ充填された付属のチューブを用いて、サンプルのPCR準備を行います。手順の3番目のステップは、感度を最大化し、非特異的増幅を排除するために慎重に最適化された条件下での温度サイクルです。最終的に、アガロースゲル電気泳動による評価を通じて、対象のサンプルにマイコプラズマが汚染されているかどうかを判定する結果を得ることができます。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、試薬が事前分注されており、高品質なPCRチューブが使用されていることです。これにより、利便性と効率性が向上します。このキットのもう一つの利点は、サンプルの1 µLあたり2個未満のマイコプラズマゲノムで汚染を検出できる点です。マイコプラズマ検出の手順を行う際は、皮膚への露出を最小限に抑えるために適切な個人用保護具を着用し、使用するすべての試薬が汚染されていないことを確認し、常に適切な無菌操作を維持して、あらゆる汚染の可能性を避けることが重要です。この手順は、細胞培養上清を用いて直接実施することも、後で使用するためにサンプルを調製しておくことも可能です。後で使用するためのサンプルを調製する場合は、各上清100 µLを滅菌済みの増幅用チューブに入れ、95 °Cで5分間インキュベートします。インキュベート後、サンプルは2～8 °Cで最大1週間保存できます。サンプルを測定する直前に、短時間遠心分離を行い、細胞残渣をペレット化します。まずPCR用のサンプルを調製するために、反応に必要なDNAポリメラーゼ再溶解バッファーの総量を決定します。1反応あたり1ユニットのDNAポリメラーゼを、適切な量の再溶解バッファーに加えます。この量は使用するTaqによって異なります。本デモンストレーションでは、JumpStart Taq DNA Polymeraseを5つの反応（サンプル3件、陽性コントロール1件、陰性コントロール1件）に使用します。計算した容量のDNA polymeraseを清潔なマイクロ遠心チューブに入れ、続いて計算した容量の再構成バッファーを加えます。チューブを軽く指で弾くようにして、DNA polymerase再構成バッファーを穏やかに混合します。この混合液をボルテックスしないでください。キットに付属している透明な反応チューブを使用して、陰性コントロールとサンプルを調製します。これらの反応チューブには、すでにヌクレオチド、プライマー、および内部コントロールDNAが含まれています。あらかじめ調製しておいたDNAポリメラーゼ再構成バッファーを23 µLピペッティングしてください。陰性コントロールおよび各サンプルのチューブ内で混合します。次に、陰性対照に2 µLのDNAフリー水を加え、各サンプルのチューブにそれぞれ2 µLのサンプルを加えます。チューブを軽く叩いて内容物を混合してください。ボルテックスミキサーで撹拌しないでください。陽性コントロールを準備するには、キットに付属しているピンク色の反応チューブを使用します。これらの反応チューブには、ヌクレオチド、プライマー、および内部コントロールDNAがすでに含まれており、25 µLのDNAポリメラーゼ再構成バッファーミックスが反応チューブに添加されています。チューブを軽く弾いて内容物を混ぜ合わせます。ボルテックスミキサーは使用しないでください。次に、陽性コントロール、陰性コントロール、およびサンプルチューブを室温で5分間インキュベートします。5分後、すべての反応チューブをサーマルサイクラーに移します。PCRについて、40サイクルの以下の条件に設定します。94 °Cで30秒間。55 °Cで30秒間、および72 °Cで40秒間。Jumpstart Taqを使用する場合、活性化ステップは不要です。PCRサイクルが完了したら、サンプルをサーマルサイクラーから取り出し、氷上に置いて4〜8 °Cまで冷却します。その後、サンプルをアガロースゲルにロードして電気泳動を行います。各PCR反応液8 µLを、それぞれ別のウェルに直接ロードしてください。サンプルをロードする前にローディングバッファーや染料を添加する必要はありません。これらは反応チューブに既に含まれています。トラッキングダイが2.5～3 cm移動したところで電気泳動を停止します。PCRによるマイコプラズマ検出の代表的な結果を、このアガロースゲルのレーンの画像に示します。2は陰性対照であり、約481 bpにバンドが認められるはずです。481 bpのネガティブコントロールバンドが出現しないことは、使用したTACの感度が不十分であったことを示す良好な指標となります。マイコプラズマ陽性サンプルでは、レーン3から6に示すように、270 ± 8 bpの範囲にバンドが現れます。汚染度が高いサンプルではバンドが濃くなり、汚染度が低いサンプルではバンドが薄くなります。すべてのサンプルには、PCRが期待通りに進行したことを証明するための内部ネガティブコントロールが含まれています。高度に汚染されたサンプルでは、内部コントロールが検出されないことがありますが、これは正常な現象です。レーン7に示されているように、ポジティブレンジとネガティブレンジの両方でバンドが消失している場合は、サンプルの反応が阻害されている可能性が高くなります。サンプルに阻害物質が含まれている場合は、DNA抽出を行うことでPCR阻害物質を除去できます。このビデオを視聴することで、キットの手順に記載されているすべての必要ステップの実行方法に加えて、結果の解釈および必要に応じたトラブルシューティングについて十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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