マイコプラズマの最適化されたPCRベースの検出

本手順の全体的な目的は、マイコプラズマ汚染の検出に最適化されたLookoutマイコプラズマPCR検出キットの使用手順を視覚的に実演することです。まず、サンプルを95 °Cまで加熱し、目的のテンプレートをPCRに適さない状態にする可能性のあるDNA分子を不活化させます。次に、ヌクレオチド、プライマー、および内部コントロールDNAがあらかじめ充填された付属のチューブを用いて、サンプルのPCR準備を行います。

手順の3番目のステップは、感度を最大化し、非特異的増幅を排除するために慎重に最適化された条件下での温度サイクルです。最終的に、アガロースゲル電気泳動による評価を通じて、対象のサンプルにマイコプラズマが汚染されているかどうかを判定する結果を得ることができます。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、試薬が事前分注されており、高品質なPCRチューブが使用されていることです。

これにより、利便性と効率性が向上します。このキットのもう一つの利点は、サンプルの1 µLあたり2個未満のマイコプラズマゲノムで汚染を検出できる点です。マイコプラズマ検出の手順を行う際は、皮膚への露出を最小限に抑えるために適切な個人用保護具を着用し、使用するすべての試薬が汚染されていないことを確認し、常に適切な無菌操作を維持して、あらゆる汚染の可能性を避けることが重要です。

この手順は、細胞培養上清を用いて直接実施することも、後で使用するためにサンプルを調製しておくことも可能です。後で使用するためのサンプルを調製する場合は、各上清100 µLを滅菌済みの増幅用チューブに入れ、95 °Cで5分間インキュベートします。インキュベート後、サンプルは2～8 °Cで最大1週間保存できます。

サンプルを測定する直前に、短時間遠心分離を行い、細胞残渣をペレット化します。まずPCR用のサンプルを調製するために、反応に必要なDNAポリメラーゼ再溶解バッファーの総量を決定します。1反応あたり1ユニットのDNAポリメラーゼを、適切な量の再溶解バッファーに加えます。この量は使用するTaqによって異なります。本デモンストレーションでは、JumpStart Taq DNA Polymeraseを5つの反応（サンプル3件、陽性コントロール1件、陰性コントロール1件）に使用します。

計算した容量のDNA polymeraseを清潔なマイクロ遠心チューブに入れ、続いて計算した容量の再構成バッファーを加えます。チューブを軽く指で弾くようにして、DNA polymerase再構成バッファーを穏やかに混合します。この混合液をボルテックスしないでください。

キットに付属している透明な反応チューブを使用して、陰性コントロールとサンプルを調製します。これらの反応チューブには、すでにヌクレオチド、プライマー、および内部コントロールDNAが含まれています。あらかじめ調製しておいたDNAポリメラーゼ再構成バッファーを23 µLピペッティングしてください。陰性コントロールおよび各サンプルのチューブ内で混合します。

次に、陰性対照に2 µLのDNAフリー水を加え、各サンプルのチューブにそれぞれ2 µLのサンプルを加えます。チューブを軽く叩いて内容物を混合してください。ボルテックスミキサーで撹拌しないでください。

陽性コントロールを準備するには、キットに付属しているピンク色の反応チューブを使用します。これらの反応チューブには、ヌクレオチド、プライマー、および内部コントロールDNAがすでに含まれており、25 µLのDNAポリメラーゼ再構成バッファーミックスが反応チューブに添加されています。チューブを軽く弾いて内容物を混ぜ合わせます。ボルテックスミキサーは使用しないでください。

次に、陽性コントロール、陰性コントロール、およびサンプルチューブを室温で5分間インキュベートします。5分後、すべての反応チューブをサーマルサイクラーに移します。PCRについて、40サイクルの以下の条件に設定します。

94 °Cで30秒間。55 °Cで30秒間、および72 °Cで40秒間。Jumpstart Taqを使用する場合、活性化ステップは不要です。

PCRサイクルが完了したら、サンプルをサーマルサイクラーから取り出し、氷上に置いて4〜8 °Cまで冷却します。その後、サンプルをアガロースゲルにロードして電気泳動を行います。各PCR反応液8 µLを、それぞれ別のウェルに直接ロードしてください。サンプルをロードする前にローディングバッファーや染料を添加する必要はありません。これらは反応チューブに既に含まれています。

トラッキングダイが2.5～3 cm移動したところで電気泳動を停止します。PCRによるマイコプラズマ検出の代表的な結果を、このアガロースゲルのレーンの画像に示します。2は陰性対照であり、約481 bpにバンドが認められるはずです。

481 bpのネガティブコントロールバンドが出現しないことは、使用したTACの感度が不十分であったことを示す良好な指標となります。マイコプラズマ陽性サンプルでは、レーン3から6に示すように、270 ± 8 bpの範囲にバンドが現れます。汚染度が高いサンプルではバンドが濃くなり、汚染度が低いサンプルではバンドが薄くなります。

すべてのサンプルには、PCRが期待通りに進行したことを証明するための内部ネガティブコントロールが含まれています。高度に汚染されたサンプルでは、内部コントロールが検出されないことがありますが、これは正常な現象です。レーン7に示されているように、ポジティブレンジとネガティブレンジの両方でバンドが消失している場合は、サンプルの反応が阻害されている可能性が高くなります。

サンプルに阻害物質が含まれている場合は、DNA抽出を行うことでPCR阻害物質を除去できます。このビデオを視聴することで、キットの手順に記載されているすべての必要ステップの実行方法に加えて、結果の解釈および必要に応じたトラブルシューティングについて十分に理解できるはずです。