プラナリアの再生を操作するために薬理学的および機能的遺伝学的アッセイ Dugesia

以下の実験の全体的な目標は、薬理学的および/または遺伝的ノックダウン法を用いて、パリアン扁形動物における再生アッセイを実施し、操作することです。最初のステップは、基本的な切断と再生のアッセイを習得することです。次に、薬物を使用して再生極性を覆す方法、たとえば双頭の動物を生み出す方法を示します。

最後に、インビボRNAiを摂食によってどのように行うかについて説明します。特定の遺伝子の機能喪失の影響を調べるため。その結果、キンタルという薬剤による治療は再生を阻害して双頭の線虫を生じさせ、ベタインとアイソフォームの遺伝的ノックダウンは極めて類似した表現型を生み出すことが示されています。

こんにちは、私の名前はジョン・チャン、マーチング研究室の大学院生で、これらの手順を実演します。これらの方法を視覚的に示すことは重要な原因ですが、それ自体は個々のステップを難しくありません。これらの手法の全体的なデモンストレーションは、このモデルシステムに不慣れな研究者を支援します。

アッセイの準備として、飢餓後少なくとも5日間、約30パリアンのコホートへの給餌を停止します。アッセイ当日の線虫の長さは8〜10ミリメートルである必要があります。プロ仕様の平らにした氷皿を水ですすぎ、鉗子を使用して平らな氷の表面をラップで覆います。

ラップの上に濾紙を1枚置きます。トランスファーピペットを使用して濾紙を数滴の湧き水で湿らせ、フィルターに20プリン以下を置きます。必要に応じて、より多くの湧き水でピペッティングし直すことにより、ウォームをフィルター上に再配置できます。

線虫が所定の位置に来たら、メスを使用して余分な液体を取り除き、動物の前部と咽頭の前端の間の約中間に1回の切り込みを入れて頭部を切断します。次に、動物の尾端と咽頭の後端との約中間に単一の切り込みを入れて、尾部を切断します。カット後、70%エタノールで湿らせたペーパータオルでメスの余分な粘液を取り除き、メスの余分なエタノールを拭き取ってから再度カットします。

鉗子でフィルターを拾い上げ、湧き水の入ったシャーレに移します。創傷のつまみと黒ずみによって観察できる創傷の閉鎖まで約3分待ちます。.濾紙から体幹の断片を再生アッセイに必要な培地が入ったシャーレにすすぎ、摂氏24度に設定されたサーモスタットインキュベーターに移します。

約1週間後に再生表現型を採点します。再生構造が同定可能な場合は、薬剤をDMSOに可溶化して200ミリモルキンタルまたはPZ Qストックを調製し、同じ日に新鮮に使用します。次に、緩衝性マジック塩の渦に22.5マイクロリットルのPZ Qストックを約1分間加えて、50ミリリットルの薬物含有溶液を作ります。

湧き水で湿らせた濾紙上にワームを挟み込み、胴体破砕再生アッセイに記載されているように頭部と尾部の両方を切断するために、切断および創傷閉鎖後、胴体断片を湧き水のペトリ皿に移す。培地を90マイクロモルのPZ Q溶液に交換し、ペトリ皿を摂氏24度のインキュベーターに移します。24〜48時間後、PZ Q含有培地を湧き水と交換し、ワームを数回洗浄し、ワームをインキュベーターに戻し、1週間後に、アッセイの前にワームの双極性または双頭性表現型をスコアリングします。

鶏レバーを均質化して準備し、脂肪の多い黄色の部分を食品ストックから廃棄し、残りの肝臓フィルターピューレを混乱させてピューレにします。ストレーナーとアクアは保管のためにサスペンションを費やします。次に、アリによってウシ赤血球またはRBCを調製し、摂氏マイナス20度で保存された1ミリリットルのサンプルに供給を引用します。

5日間飢餓状態になった線虫を使用し、3つのコホートにグループ化します。目的の遺伝子は、既知のRNAi表現型とネガティブコントロールを持つ遺伝子をポジティブコントロールします。RNAi表現型を持たない遺伝子。

各コホートには、長さが 8 から 10 mm の約 250 匹の線虫を使用します。二本鎖RNAを発現する各コホートの大腸菌のストックを解凍し、関心のある遺伝子を標的とし、鶏、肝臓、均質化物、およびRBCのチューブと一緒に、13, 000 Gs.For 1分間で遠心融合によって細菌をペレット化します。スーパーネイトを除去し、2つのXYT培地の700マイクロリットルでペレットを再懸濁します。

再遠心分離機にかけ、上清を捨ててから、ペレットを氷の上に置きます。大口径のP 200ピペットチップをチップを完全に切断し、細菌ペレットを150マイクロリットルの鶏レバーホモジネートと50マイクロリットルのRBCに再懸濁して、RNAiフィーディングミックスを作成します。短い遠心分離パルスで気泡を取り除き、供給します。

ワームを含むプラスチック製の浴槽から水の大部分を取り除き、約1インチの深さを残します。浴槽を回転させて、この容器の中央にワームを集中させます。そして、RNAIの給餌ミックスを円を描くようにピペットで動かし、ワームを囲い込みます。

トランスファーピペットを使用して、約1時間給餌した後、他のダイナーを混乱させることなく、脱走者をRNAi給餌ミックスに慎重に戻します。また、十分に給餌したパリアンを特定し、十分に給餌されていないように見えるワームを取り除きます。十分に餌を与えられたワーム。摂取したRBCから深みのある赤色を示します。

餌の摂取を防ぐために、乱れを最小限に抑えるように注意しながら、給餌液を新鮮な湧き水に慎重に交換してください。これを行うには、トランスファーパイプを使用してワームを浴槽の片側に穏やかに位置付けます。泥水を注ぎ、慎重に浴槽の反対側の壁に注がれた真水と交換し、空気に長時間さらされるとすぐにパリアンを沈めます。

また、食物摂取が緩い結果になります。容器の蓋を密封し、ワームを摂氏24度のインキュベーターに戻します。このRNAiフィーディングプロトコルを、再生サイクルを挟んだ複数のサイクルにわたって繰り返し、最終的にRNAi表現型をスクリーニングします。

ここでは、多くの遺伝子に効果的な標準的な摂食および再生スケジュールを示しています。Fは供給プロトコルを表し、Xは再生アッセイを表します。合計で、プロトコルは約1か月かかり、最適なプロトコルはmRNAの安定性、組織局在、タンパク質、P dur、または再生後の複数の摂食サイクルを排除する表現型の発達などの要因に依存するため、括弧Fまたはそれ以上の摂食数で表されるより少ない遺伝子を含めることによって、異なる遺伝子に変更することができます。

これは、体幹再生アッセイの典型的な結果です。左側には、切断切断を示す回路図の上にパリアンが示されています。右側は、7日間にわたって行われる体幹断片の再生の時間経過を示しており、3日目までに眼の斑点が現れます。

ここでは、PZ Q.Treatmentによる体幹断片再生の薬理学的転覆により、遺伝子DJ 61に対するRNAiを用いた双頭の線虫が得られました。FX FXの供給プロトコルでは、線彩表現型が生じ、FFFXの供給プロトコルの後に見られる光嫌悪反応の喪失により、移動制御と比較して、動かないDJ PC 2つのRNAiワームが赤く染まります。ワーム染色された緑色のRNAiは、DJベータカチンを1つにノックダウンしました。

FXFXフィーディングプロトコルを使用すると、後部の傷から頭部が再生されます。これらの手順を踏むと、研究者はノックダウン法または選択的薬理学的薬剤のいずれかを使用して、研究に関心のある遺伝子を標的とし、パリアン生物学と組織再生におけるそれらの役割を探求することができます。