Name: プラナリアの再生を操作するために薬理学的および機能的遺伝学的アッセイ Dugesia /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶプラナリアの再生アッセイにおける薬理学的操作と遺伝的ノックダウン法。Dugesia japonicaを用いた切断実験とin vivo RNAi技術により、幹細胞分化と組織再生のメカニズムを解明する方法を習得できます。

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1。トランクのフラグメントの再生アッセイ<ol><li>動物を確保するために再生アッセイ前に少なくとも5日間ワームのコホートを供給停止は、廃棄物や摂取した食べ物（〜30そのままワーム、それぞれのワーム〜8〜10ミリメートル長いポスト飢餓）は無料です。 </li><li>検定の日に、水で事前に冷凍水平に氷皿を洗い、ラップで平らなアイス表面を覆う。鉗子を使用して、ラップで1つろ紙を置きます。 </li><li>春の数滴の水でろ紙を湿ら。トランスファーピペットを使用して、フィルタ（フィルタあたり&lt;20ワーム）の上にプラナリアを転送します。ワームは、より多くの温泉水でrepipettingで、必要に応じて、フィルタを再配置することができます。余分な水分を取り除きます。 </li><li>メスを使用して、動物や咽頭の前端（ 図1A）の前方頂点間のほぼ中間に作られたシングルカットで頭部を切断する。 </li><li>メスを使用して、約半分尾の動物の終わりと咽頭（ 図1A）の後端との間に作られたシングルカットで尾部を切断する。カットした後70％エタノールで湿らせたペーパータオルを使用してメスで余分な粘液を取り除く。メスから余分なエタノールを拭きます。 </li><li>春の水を含むペトリ皿（100 × 25ミリメートルの深さ）にピンセットを介してフィルタを転送する。 （創縫合のための、傷のピンチと暗くによる観測）〜3分間待ちます。 </li><li>ろ紙からの回生アッセイと恒温インキュベーターへの転送（24℃）の所望の培地を含むペトリ皿にトランクの断片をすすぎます。 </li><li>再生の構造は（ 図1A）識別可能〜1週間後にスコアが再生表現型、。 </li></ol> 2。プラジカンテルにより誘導される二極化：再生の薬理学的操作<ol><li> DMSOに可溶化薬剤（200mmの株式に対して1mLので62.4mg PZQ）によってプラジカンテル（PZQ）株式を準備します。同じ日に使用してください。 </li><li>バッファMontjuch塩の薬物含有溶液（90μMPZQ）の50mLのを確認。分散性を確保するために〜1分間ボルテックス。 </li><li>最後のステップ[1.7]でPZQにトランクのフラグメントのコホートを公開する、[プロトコル＃1]上記の詳細として、トランクの断片回生アッセイを実行します。 </li><li> 24-48時間後に、交換PZQ含有、湧水のためのメディアをワームのいくつかの（&gt; 3）回洗浄。 </li><li>インキュベーターにワームを返します。スコアの二極化（二頭、 図1B）切断後一週間。 </li></ol> 3。再生の遺伝子操作：in vivoでのRNAi送りプロトコルで <ol><li>アッセイ前に、鶏の肝臓ホモジネートを準備。 foodstockから脂肪、黄色のセクション、ピューレ、残りの肝臓を捨てる。ストレージのためのメッシュのストレーナー、アリコートの懸濁液（1.5mlのチューブ、-20 ° C）を介してフィルタピューレ。 </li><li>アッセイ前に、-20℃で保存され、1mLの試料に供給を小分けでウシ赤血球（RBC）を準備する</li><li> RNAiのワームを選択します。 3つのコホートが使用されています：目的の遺伝子、ポジティブコントロール（既知のRNAi表現型を有する遺伝子; 図1C、D＆E）とネガティブコントロール（無RNAiの表現型を有する遺伝子、実験的なコホートと比較してノックダウンレベルの評価にも有用）。各コホートの場合は、〜250ワームを（少なくとも5日間飢え後に長い〜8〜10ミリメートル）を使用します。プラスチック製の浴槽で温泉水に保管してください。 </li><li>興味のdsRNA標的遺伝子を発現する大腸菌の各RNAiコホート、雪解けストックの[8]、鶏の肝臓ホモジネートのチューブと一緒に[3.1]と赤血球のチューブ[3.2]。 </li><li>ペレット細菌（13,000 G、1分）。 2xYTメディア（〜700μl）で上清とペレットを再懸濁しますを削除します。 Recentrifugeは、氷の上清、場所ペレットを捨てる。 </li><li>チップの先端をカットすることで大口径P200のピペットチップを作成します。徹底的にRNAiの供給ミックスを作成するために鶏肝臓ホモジネート（150μL）と赤血球（50μL）の混合物で、細菌ペレットを再懸濁します。遠心により気泡を取り除きます。 </li><li>給餌の場合は、ワームを（〜1インチの深さを残す）を含むプラスチックの浴槽からの水の大部分を取り除く。このコンテナの中心にワームを集中させるスワール浴槽、およびワームをcorralling円でピペットのRNAi給餌ミックス。慎重に他の食事を乱すことなく、RNAiの給餌ミックスに戻って脱出を同軸ケーブルに転送ピペットを使用してください！ </li><li>給餌（〜1時間）した後、よく飼育プラナリアを識別する。これらのワームは、摂取した赤血球から深い赤の着色を示す。他人を捨てる。 </li><li>慎重に、新鮮な湧き水を使用してソリューションを供給する食品の排せつ物を防ぐために、妨害を最小限に置き換えます。これを行うには、静かに濁った水を注ぐ、転送ピペットを用いてチューブの片側にワームをローカライズし、慎重に新鮮な水で置き換えるには、浴槽の反対側の壁を注いだ。再び潜水するのプラナリアは、すぐに空気に長時間さらされるとしても、食品の排せつ物をもたらす。 </li><li>疎SEらの容器のふたやインキュベーターに復帰（24 ° C） </li><li>再生サイクル[プロトコル＃1]のRNAi表現型をスクリーニングするためのを織り交ぜ、複数のサイクルにわたるRNAiの給餌プロトコル（離れて2〜3日間）、繰り返します。多くの遺伝子のための効果的な給餌と再生のための標準プロトコルは、継続時間の合計で1ヶ月〜かかる図2に示されています。 </li></ol>最適なプロトコルはこのようなmRNAの安定性、組織局在性、タンパク質のperdurance、または再生後に複数の給餌サイクルを排除する表現型の開発などの要因に左右されるように、異なる遺伝子のためにこのスキームを変更します。単にネガティブコントロールのコホートで標的mRNAレベルを比較する表現型の浸透率（見かけの場合）のため、または定量PCR手法でスクリーニングすることによって、ノックダウンのレベルを評価する。 4。代表的な結果： トランクのフラグメントの再生アッセイでは、すべてのワームは、通常の前後（"尾に頭'）極性で再生成する必要がありますように堅牢です。これは、前eyespotsの出現（asterixed、 図1A）により促進、カットした後五日するとすぐに得点することができます。しかし、失われた構造物の完全な形態学的な復元は一週間後に発生します。双頭のワームを得るためにPZQによるトランクの断片の再生の薬理学的操作（ 図1B）も堅牢である（EC 50 = 87（+ - ）11％バイポーラフラグメント、48時間2070μMPZQ）。二極化は、単一の再生サイクルを介して行われます。これらのアッセイの下の有効性は、おそらく薬の溶解性および/またはストレージに関する問題、またはPZQは効果がない別の扁形動物の種の使用にも関する。低浸透率を有する薬剤の場合は、anteriorizationのインデックスは、多くの場合、完全な二極22から脇の中間表現型を獲得するために使用されます。正の制御構文のRNAi実験に起因する表現型を図1に示されています： ニホンDugesiaのRNAi 六1（D J六- 1）目のない表現型23（ 図1C）、Dugesia ジャポニカPC2のRNAi（DJ - PC2）の結果光嫌悪反応24（ 図1D）とのRNAiの損失の結果Dugesiaスギβcatenin- 1（DJ -βcatenin- 1）トランクのフラグメント（ 図1E）から双頭の表現型16-19、21の結果。これらの表現型は、次のような単純なRNAiのプロトコルを使用して達成することができます：DJ -六1（FFxFx）、DJ - PC2（FFFx）、DJ -βcatenin- 1（FFxFx）、ここで、F =給餌サイクルとx =再生サイクルそれぞれ。 <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig1.jpg" alt="図1"> 図1：トランクのフラグメントの再生アッセイ左 、プラナリアの画像（上）と回路図（中央）切り出したトランクのフラグメントの位置を示すために右 、指示された時間（日数）で再生フラグメントの外観を示すトランクのフラグメントの再生のtimecourse B。。。 PZQの曝露によって生成される。双頭のプラナリアの画像DJ -六1のRNAi。モバイルコントロールのワームに比べて不動のDJ - PC2のRNAiワーム（ステンドグラス赤）の光嫌悪反応のDの損失、（ステンドによって生成されたC'目のない"ワーム緑）。Eバイポーラプラナリアは、DJ -βcatenin- 1 RNAiにより作り出した。 BEで、RNAiはワームのオリジナルの前端には、左に指向です。 <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig2.jpg" alt="図2"> 図2：D.における多くの遺伝子のノックダウンに有効である、複数の栄養（F）、及び再生サイクルを構成する典型的なRNAiのプロトコル（x）の供給と切断サイクルのシーケンスジャポニカ 。個々の遺伝子のためのこのプロトコルの変更が少ない（括弧）や給餌と再生のサイクルのより大きい数を使用する例については、最適な結果を得ることが必要になることがあります。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

プロトコルは、 ジャポニカプラナリアDugesiaの再生を研究し、操作するためここに詳細のアッセイを説明した。彼らは単純なものであり、それらは容易に実験室や教室で行うことができるというような特殊な機器を必要としません。アッセイは個別に実行、または組み合わせて（in vivoでの薬物の効能の化学遺伝学的スクリーニングのための）と候補遺伝子レベルで行うことができる、または公正な、より高いスループットスクリーニング8に適応可能であることができる。自分の右側にプラナリアの興味深い生物学を研究するためかどうか、または組織再生を研究するための代替モデルの哺乳類ホモログの in vivo機能で評価するために、これらのアプローチは、研究者の多様な範囲からの関心を触媒してください。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬</th><th>ベンダ</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>春の水</td><td> Kandiyohi。プレミアムウォーターズ株式会社ミネアポリス、ミネソタ州</td><td> N / A </td><td>温泉水の他の形態も良好に動作します。生存率アッセイで初の試み。 </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（1.6mm厚）、塩化カルシウム（1mMの）、硫酸マグネシウム（1mMの）、MgCl2の（0.1）、塩化カリウム（0.1）、NaHCO3水溶液（さ1.2mm）、HEPES（1.5mmの）：1 xは、モンジュック塩をバッファ。 24でpH7.4の℃の</td><td>複数のベンダー</td><td> N / A </td><td> pH緩衝性を確保するために再生アッセイ中の薬物治療のための人工的な水。 5月8日Holtfreterのソリューションは、代替手段です。 </td></tr><tr><td> 2xYT培地</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP2467 - 500 </td><td>メディア= 31グラム/ L。オートクレーブ。 </td></tr><tr><td>ペトリディッシュ（100x25mm） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 08-757-11 </td><td>再生サイクルの間に住宅のワーム</td></tr><tr><td>スクエアディッシュ（100x100x15mm） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 08から757 - 11A </td><td>ワーム切断面として使用される製氷皿に水、凍結で埋める</td></tr><tr><td>プラスチック製の浴槽：ジップロックツイスト&#39;N LOC（16オンス）。 </td><td>様々な小売業者</td><td> N / A </td><td> RNAiのコホートに便利な防水容器</td></tr><tr><td>鶏のレバー</td><td>商業用食料品</td><td> N / A </td><td>抗生物質の回避により、有機供給に向けてバイアス、。 </td></tr><tr><td>ハンドブレンダー</td><td>あらゆる台所のサプライヤー</td><td> N / A </td><td>鶏レバーのピューレを作るために使用</td></tr><tr><td>ワイヤー1ミリメートルメッシュストレーナー</td><td>あらゆる台所のサプライヤー</td><td> N / A </td><td>鶏レバーのピューレに負担をかけるために使用</td></tr><tr><td>ウシ赤血球</td><td> Lampire生物研究所</td><td> 7240807 </td><td> 100パーセントRBC懸濁液を洗​​浄し、プール</td></tr><tr><td>円形のろ紙</td><td>ワットマン＃3 </td><td> 1003 055 </td><td></td></tr><tr><td>注入器</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 13-711-41 </td><td></td></tr><tr><td>滅菌、外科ブレード</td><td>複数のベンダー</td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> ±プラジカンテル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P4668 </td><td> 4℃で暗所に保管して粉体のアリコート℃の生気を奪う。 </td></tr><tr><td> DJ六- 1 </td><td></td><td> GenBankのAJ557022.1 </td><td> &quot;目のない&quot;表現型は23 RNAi実験のポジティブコントロール</td></tr><tr><td> DJ -βcatenin- 1 </td><td></td><td> GenBankのAB181913.1 </td><td>双頭の表現型17のRNAi実験のポジティブコントロール</td></tr><tr><td> DJ - PC2 </td><td></td><td></td><td>羞明の表現型24の損失のためのRNAiのポジティブコントロール</td></tr></tbody></table>

プラナリアの再生を操作するために薬理学的および機能的遺伝学的アッセイ<emジャポニカ> dugesia</em

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

自由生活プラナリアの扁形動物は彼らの驚くべき再生能力を1から実験的な利用等により、長い歴史を持っている。これらの動物から摘出された小さな断片が欠落しているボディ構造の再生に続くオリジナルのボディプランを改革。 &quot;トランク&quot;の断片がそのままワームから切断されている場合、例えば、新たな&quot;頭は&quot;前方に生成されると&quot;尾&quot;は（ 図切断する前の元のボディ構造の&quot;頭部と尾部&quot;極性を復元後方に再生成されます1A）。 再生は通常の身体の恒常性と強制組織の再生中に〜30の異なる細胞型に分化&quot;neoblasts&quot;として知られるプラナリア幹細胞、によって駆動されます。この再生過程では、実証するため、強力かつ簡単です。いくつかの先駆的なラボの献身のおかげでは、多くのツールと​​機能的遺伝学的手法は、現在このモデルシステムに最適化されています。その結果、かなりの最近の進展は、プラナリアの発達可塑性2-9を支える分子事象を理解し、操作で行われている。 プラナリアのモデルシステムは、科学の広い範囲に興味を持ってもらえるでしょう。神経科学者のために、モデルは単純に全体の神経系の再生ではなく、通常は多くの確立されたモデルでの研究の焦点となっている単一の神経細胞のプロセスの再生/修復を勉強する機会を与えてくれます。プラナリアは、神経伝達物質10の茄多を表現する中枢神経系11、12の進化を研究するための重要なシステムを表しており、行動のスクリーニングの可能性13、14を持っている。 再生結果は、薬理学的および遺伝的apparoachesによる操作に適している。例えば、薬は単に切断後の異なる時点で薬剤を含む溶液中で身体の断片を配置することによって、再生への影響についてスクリーニングすることができる。個々の遺伝子の役割は、マイクロインジェクションのサイクルを介して、または細菌で発現された二本鎖RNAの構造8、9、15を供給することにより、どちらかを達成することができるノックダウン方式（ 生体 RNAi の ）、使って研究することができます。どちらのアプローチは、バイポーラの動物16から21までの高い浸透率、たとえば、再生時に視覚的に印象的な表現型を生成することができます。このようなメソッドのこのモデルと実装の ​​採用を促進するために、我々はプラナリアDugesiaはジャポニカ使用して薬理学的および遺伝学的ア ​​ッセイ（in vivoでのRNAi の摂食による）のためのこのビデオの記事プロトコルで披露。

生きた動物の中で幹細胞の分化を研究するための魅力的なモデルは、プラナリア扁形動物です。再生は簡単に基本的な実験室で行われる単純な切断実験により研究し、薬理学的および遺伝的（に適しているさ<em&gt; in vivoで</em&gt; RNAi）は、この記事ではプロトコルで詳述するように操作。

プラナリアの再生を操作するために薬理学的および機能的遺伝学的アッセイ<emジャポニカ> Dugesia</em

自由生活性のプラナリア（扁形動物）は、その驚異的な再生能力により、実験的に利用されてきた長い歴史を持つ1。...から切り出された小さな断片は、

以降の実験の全体的な目的は、薬理学的および／または遺伝的ノックダウン法を用いて、パリアン・プランナリアにおける再生アッセイの実施および操作を行うことです。最初のステップでは、基本的な切断および再生アッセイの手法を習得します。次に、薬剤を用いて再生の極性を転換し、例えば2つの頭を持つ個体を誘導する方法について示します。最後に、フィーディングによるin vivo RNAiの実施方法について説明します。これは、特定の遺伝子の機能喪失による影響を調べるためのものです。結果として、薬剤quintalによる処理は再生を阻害し、2つの頭を持つ虫を産生させることが示されました。また、betaineおよびそのアイソフォームの遺伝的ノックダウンによっても、極めて類似した表現型が誘導されます。こんにちは。私はmarching laboratoryの大学院生のJohn Chanです。これらの手順について実演します。個々のステップ自体は難しくありませんが、これらの手法を視覚的に示すことは重要です。これらの技術を全体的に実演することで、このモデルシステムを初めて扱う研究者の助けとなるでしょう。アッセイの準備として、約30匹のparianのコホートを、飢餓状態にしてから少なくとも5日間絶食させます。アッセイ当日の虫体の長さは8～10 mmである必要があります。あらかじめ水平に調整した氷皿を水ですすぎ、ピンセットを用いて平坦な氷の表面をプラスチックラップで覆います。プラスチックラップの上にフィルターペーパーを1枚置きます。転送ピペットを用いて、フィルターペーパーに天然水の数滴を垂らして湿らせ、フィルター上に20匹以上の線虫を置かないようにします。必要に応じて、さらに天然水を加えてピペッティングし、フィルター上の線虫の位置を調整してください。線虫を定位置に配置した後、メスを用いて余分な液体を取り除き、動物の前端と咽頭の前端のほぼ中間あたりで1回切断して頭部を切除します。次に、動物の尾端と咽頭の後端のほぼ中間あたりで1回切断し、尾部を切除します。切断後、70% ethanolを湿らせたペーパータオルでメス上の余分な粘液を取り除き、再度切断する前にメスから余分なethanolを拭き取ってください。ピンセットでフィルターを拾い上げ、湧水を入れたシャーレに移します。傷口が閉じ、絞られて暗色に変化するのが観察されるまで、約3分間待ちます。フィルターペーパーから、再生アッセイ用の所望の培地を入れたシャーレに体幹断片を洗い流し、24 °Cに設定した恒温インキュベーターに移します。約1週間後に再生表現型をスコアします。再生構造が確認できたら、薬剤をDMSOに溶解させ、当日中に使用する200 millimolarのPZ Qストック溶液を調製します。次に、22.5 µLのPZ Qストック溶液を緩衝Majic saltsに添加し、約1分間ボルテックスして、薬剤含有溶液を50 mL調製します。分散を確実にするため、ウォームを湧水で湿らせたフィルターペーパー上に置き、「体幹断片化再生アッセイ（trunk fragmentation regeneration assay）」で説明されている手順に従って、頭部と尾部の両方を切断します。切断および創傷閉鎖後、体幹断片を湧水を入れたペトリ皿に移します。培地を 90 µM の PZ Q 溶液に交換し、ペトリ皿を 24 °C のインキュベーターに移します。24 ～ 48 時間後、PZ Q 含有培地を湧水に交換してウォームを数回洗浄し、ウォームをインキュベーターに戻します。1 週間後、アッセイに先立ってウォームの双極性または二頭性の表現型をスコアします。鶏レバーホモジネートを調製します。食用ストックから脂肪分の多い黄色い部分を取り除き、残りのレバーをピューレ状にしてメッシュストレイナーでろ過します。その後、保存用に懸濁液を準備します。次に、ウシ赤血球（RBC）を調製し、1 mLずつのサンプルに分注して-20 °Cで保存します。5日間にわたって飢餓状態にした線虫を用い、3つの群に分けます。目的遺伝子、陽性対照（RNAi表現型が既知の遺伝子）、および陰性対照（RNAi表現型を示さない遺伝子）を用意します。各コホートにつき、長さ8〜10 mmの線虫を約250匹使用します。標的遺伝子に対する二本鎖RNAを発現するE. coliのストックを各コホート分、およびニワトリ肝臓ホモゲネートのチューブとRBCのチューブを融解します。13,000 Gで1分間遠心分離し、細菌をペレット化します。上清を除去し、ペレットを700 µLの2X YT培地で再懸濁します。再度遠心分離を行い、上清を捨ててからペレットを氷上に置きます。P 200 ピペットチップの先端を切って広口チップを作成し、細菌ペレットを 150 µL のニワトリレバーホモジネートと 50 µL の RBCs に完全に再懸濁して、RNAi 給餌用ミックスを作成します。給餌前に、短時間の遠心パルスで気泡を除去してください。線虫が入ったプラスチック容器から水の大部分を取り除き、水深を約1インチまで下げます。容器を軽く回して、線虫を中央に集めます。その後、RNAIフィーディングミックスを円を描くようにピペットで滴下し、線虫を囲い込みます。転送ピペットを使用して、他の個体を乱さないように注意しながら、逃げ出した個体をRNAi給餌ミックスへと慎重に戻します。約1時間の給餌後、十分に摂食した個体を特定し、十分に摂食していないように見える個体を取り除きます。十分に摂食した個体は、取り込まれたRBCにより濃い赤色を呈します。餌の摂取を防ぐため、撹乱を最小限に抑えながら、給餌液を新鮮な湧水に慎重に交換します。そのためには、転送パイプを使用して、 worm を容器の片側に緩やかに集めてください。汚れた水を捨て、容器の反対側の壁に沿って新鮮な水を慎重に注ぎ入れます。空気への長時間露光を避けるため、速やかに再浸漬させてください。また、これにより緩やかに餌の摂取が促されます。容器の蓋を密閉し、線虫を24 °Cのインキュベーターに戻します。最終的にRNAi表現型をスクリーニングするため、このRNAi摂食プロトコルを、再生サイクルを挟みながら複数サイクル繰り返します。多くの遺伝子に有効な標準的な給餌および再生スケジュールをここに示します。Fは給餌プロトコルを、Xは再生アッセイを表します。プロトコル全体で約1ヶ月を要し、mRNAの安定性、組織局在、タンパク質の半減期、または再生後に複数回の給餌サイクルを妨げる表現型の発現などの要因によって最適なプロトコルが異なるため、給餌回数を少なく（括弧で囲まれたFで表示）したり、あるいは増やしたりすることで、異なる遺伝子に合わせて調整が可能です。以下は、体幹再生アッセイの典型的な結果です。左側には、切断部位を示す模式図の上にパリアン（parian）が示されています。右側は、7日間にわたる体幹断片の再生のタイムコースであり、3日目までに眼点が出現しています。ここでは、PZ Qによる体幹断片再形成の薬理学的妨害について述べる。DJ 61遺伝子に対するRNAi処理により、頭部が2つの個体が得られた。FX FX給餌プロトコルではilis表現型となり、FFFX給餌プロトコルの後には光忌避反応の消失が見られた。赤色に染色されたDJ PC two RNAi個体は、可動的なコントロール群と比較して不動であった。一方、緑色に染色された個体では、DJ beta catineのRNAiによるノックダウンが認められた。FXFX給餌プロトコルを用いることで、後方の創傷部位から頭部の再生が誘導されます。これらの手順に従うことで、研究者はノックダウン法または選択的な薬理学的薬剤を用いて、研究対象となる遺伝子を標的とし、パリアンの生物学および組織再生におけるそれらの役割を探索することが可能になります。

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プラナリアの再生を操作するために薬理学的および機能的遺伝学的アッセイ Dugesia

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