ステロイド受容体の生化学的再構成には、•Hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化

この手順の全体的な目的は、ステロイド受容体HSB 90タンパク質複合体を生化学的に再構成し、ステロイド受容体のリガンド結合活性を再活性化させることであり、これによりHSB 90の共因子の必要性や、再構成プロセスに外来化合物を添加した際の影響を検証することができます。これは、まず機能的なグルココルチコイド受容体を含む細胞質を調製することによって達成されます。次に、細胞質からGRを免疫吸着し、内因性のものを除去します。

HSP 90が解離します。次に、外来源のHSP 90およびその他のシャペロンタンパク質とコファクターを用いて、GR HSP 90ヘテロ複合体を再構成します。最後に、再構成されたタンパク質複合体とリガンド結合活性を解析します。具体的には、SDS page、ウェスタンブロッティング、および放射性リガンド結合アッセイなどの手法を用いて、GR HSP 90ヘテロ複合体の形成とステロイド結合活性を示します。

本手法は、HSP 90の機能的活性を促進するためにどのような共因子シャペロンやCOSシャペロンが必要であるかなど、HSP 90分子シャペロン分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。本手法はタンパク質折り畳みに関する知見を提供できるだけでなく、HSP 90依存的なリード化合物の開発や、HSP 90を必要とする細胞内シグナル伝達経路の解析など、他の系にも適用可能です。本手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室を最近卒業した学生であるHannah FranklinとNathan for AWAの2名です。機能的なグルココルチコイド受容体（GR）を単離するには、対数増殖期にあるマウス線維芽細胞L 9 29細胞、またはリコンビナントGRバキュロウイルスの感染させたSf9細胞を培養します。細胞懸濁液を4 °Cで5,000 ×gにて5分間遠心分離します。

得られたペレットの体積は約1〜5 mLになるはずです。細胞ペレットを15 mLのハンクス平衡塩類溶液（HBSS）で3回洗浄します。1 mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含むHEMバッファーと、ダウンストンで50回的に粉砕した3錠の完全ミニプロテアーゼ阻害剤タブレットを含むホモジナイズバッファーを、1.5倍量用意します。

ホモジナイザーで細胞を破砕し、タンパク質の分解を防ぐため、この操作は氷上で行いました。ホモジネートを、4 °Cで100,000 Gsにて30分間超遠心分離しました。細胞質を含む上清を、1.5 mLマイクロ遠心チューブに500 µLずつ分注し、-20 °Cで保存しました。

受容体特異的GRに対するモノクローナルIgG抗体を含む混合液を調製するには、解凍したGR含有細胞質液100 µL、TEGM緩衝液200 µL、20%タンパク質AセロまたはPASスラリー100 µL、およびbugger 2などの抗GモノクローナルIgG抗体5 µgを混合します。PASビーズのサイズが比較的大きいため、

先端をカットしたP 200ピペットチップを使用して、20%スラリーからPASをサンプルチューブに分注します。サンプルを垂直回転ホイールにセットし、一定の速度で回転させながら最低2時間インキュベートします。次に、サンプルを冷却遠心機で1分間遠心分離し、抗体PASペレットから未結合のタンパク質を除去します。

10,000 Gsで遠心分離し、1 mLのTEGMバッファーを加えてボルテックスした後、再度遠心分離することを2回繰り返し、ペレットを洗浄する。エンドゲナスHSB 90をGR免疫ペレットから解離させるため、クリンプ処理したP 200ピペットチップを用いて最終洗浄液を除去し、355 µLのTEGバッファーと45 µLの5 M塩化ナトリウムを抗体ペレットに加える。

サンプルを垂直回転ホイールに設置し、一定の速度で回転させながら1時間半インキュベートします。10,000 Gsで1分間遠心分離し、免疫ペレットから未結合タンパク質を除去します。ペレットを1 mLのTEGバッファーで1回、次いで10 mM HEPESバッファー（pH 7.4）で1回洗浄します。ペレットを乱さないように注意しながら、カットチップのP 200ピペットで洗浄液を除去します。

GR HSB 90ヘテロ複合体を再構成するために、ペレットにウサギ網赤血球溶解物などの分子シャペロン源 50 µL と、ATP生成系 5 µL を含む混合液を加えます。次のステップは、ペレットと再構成溶液を十分に混合させるために極めて重要です。サンプルを 30 °C のウォーターバスで正確に 20 分間インキュベートします。

ペレットを穏やかに分散させ、再構成溶液を混合するため、1〜2分ごとにチューブを軽く弾いてください。1 mLのTEGMバッファーを加え、ボルテックスした後、10,000 Gsで1分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、上清を除去します。

再構成したペレット中のタンパク質を同定するため、洗浄をさらに2回繰り返します。β-メルカプトエタノールを含むSDS-PAGEサンプルバッファーを50 µL添加し、電気泳動用のサンプルを調製します。サンプルを混合し、沸騰水浴または100 °Cの電子ヒートブロックで5分間インキュベートします。

サンプルを10,000 Gsで1分間遠心分離します。これらのサンプルの上清を、SDS-PAGEまたはマイクロ流体電気泳動およびその後のウェスタンブロットに使用します。上清の分注にP 200のカットチップを使用することで、ペレットを誤って吸引することを防ぐことができます。

次のステップは、GR HSP 90タンパク質複合体のステロイド結合活性を測定することです。トリチウム標識ステロイドを用い、再構成した免疫ペレットに47.5 µLのHEMバッファーと2.5 µLの2 µMトリチウム標識デキサメタゾンを添加することから始めてください。

マイクロ遠心チューブの壁面にサンプルが付着するのを最小限に抑えるよう注意しながら、ペレットを穏やかに混合します。サンプルを氷上で一晩静置してインキュベートします。1 mLのTEGM緩衝液を加え、穏やかに混合した後、10,000 ×gで1分間遠心分離します。

注意深く上清を廃棄します。上清には未結合のトリチウム標識ステロイドが含まれています。TEGMバッファーを用いて計3回の洗浄を完全に行います。最後の洗浄後、すべての上清を除去します。

クリンプ加工したP 200ピペットチップを使用します。洗浄後の免疫ペレットを200 µLのTEGMバッファーに懸濁し、10 mLのシンチレーションバイアルに移します。

4.8 millilitersのシンティレーションカクテルをバイアルに加え、ボルテックスします。最後に、液体シンティレーションスペクトロメトリーを行います。代表的なSDS-PAGEおよびウェスタンブロットのデータが、このクマシ染色ゲルに示されています。内因性GR-HSP90ヘテロ複合体を抗GR抗体を用いて細胞質から免疫吸着し、GRと共に共吸着された個々のタンパク質を可視化しています。

以下は、再構成されたGR HSP 90ヘテロ複合体を示すマイクロ流体電気泳動データです。GR免疫吸着の特異性は、抗GR抗体を非免疫抗体に置換することで確認されており、過剰量を用いた場合でもGRや分子シャペロンの免疫沈殿は認められません。

同様に、塩でストリッピングしたGRからHSP 90およびその他のシャペロンタンパク質が解離していることは、ストリッピング後および再構成後の免疫沈殿ペレットのウェスタンブロッティングによって確認することが可能です。免疫吸着抗体の重鎖は、クマシー染色とウェスタンブロッティングの両方で検出でき、これにより各レーンで同量の免疫沈殿ペレットが可視化されていることが確認されます。網状赤血球ライセートまたは精製タンパク質のいずれかを用いた、免疫吸着GRの代表的なステロイド結合活性データをここに示します。

再構成したGR-HSP90ヘテロ複合体のステロイド結合活性は、通常、内因性のGR-HSP90結合活性レベルの75〜100%まで回復します。電気泳動のデータと同様に、抗GR抗体の代わりに非免疫抗体をネガティブコントロールとして使用し、非特異的なトリチウム標識ステロイド結合を測定できます。この手順の後、2Dゲル電気泳動などの他の手法を実施することで、HSP90の翻訳後修飾がヘテロ複合体の再構成およびステロイド結合にどのような影響を与えるかといった、さらなる疑問を明らかにできます。ここで述べたような再構成アッセイにより、研究者はグルココルチコイド受容体をモデルHSP90クライアントタンパク質として用い、HSP90およびHSP70に基づくMultiProシャペロン機構の機能的な意義とその段階的なアセンブリについて探究することが可能になりました。

このビデオを視聴することで、細胞溶解液中の精製タンパク質から機能的なグルココルチコイド受容体HSP 90タンパク質複合体を調製する方法を十分に理解できるはずです。その手順には、GR含有細胞溶解液の調製、受容体の免疫吸収、内因性タンパク質のソルトストリッピング、および外因性HSP 90、HSP 70共因子、共シャペロンを用いたヘテロ複合体の再構成が含まれます。