Name: ステロイド受容体の生化学的再構成には、•Hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学ぶグルココルチコイド受容体・Hsp90タンパク質複合体の生化学的再構成法。免疫吸着、塩処理、再構成を通じてリガンド結合活性を再活性化し、コファクター要件と薬剤開発への応用を解明する。

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この作品は、健康補助金GM086822、希望心臓研究所基礎科学賞、そしてMJマードック公益信託の大学の科学研究開発プログラムの国民の協会によって資金を供給された。電気泳動の試薬を選択して、画像解析ソフトウェアは、寛大にBio - Rad社から提供されました。

<ol><li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signaling+protein+function+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery.</a> Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucocorticoid+receptor+steroid+binding+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%3A+implications+for+clinical+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention.</a> Leukemia. 19, 710-712 (2005).</li>
<li>Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery+regulates+signaling+by+modulating+ligand+binding+clefts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts.</a> J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).</li>
<li>Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+steroid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+assembly+system+of+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).</li>
<li>Morishima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp+organizer+protein+hop+enhances+the+rate+of+but+is+not+essential+for+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+multiprotein+Hsp90-based+chaperone+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system.</a> J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry%2C+abundance%2C+and+functional+significance+of+the+hsp90%2Fhsp70-based+multiprotein+chaperone+machinery+in+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).</li>
<li>Dittmar, K. D., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+glucocorticoid+receptor+by+the+reconstituted+Hsp90-based+chaperone+machinery.+The+initial+hsp90.p60.hsp70-dependent+step+is+sufficient+for+creating+the+steroid+binding+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation.</a> J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).</li>
<li>Kanelakis, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+the+hsp70-binding+protein+BAG-1+on+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+hsp90-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).</li>
<li>Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+iterative+ratcheting+of+receptor-bound+hsp70+between+its+ATP+and+ADP+conformations+during+assembly+of+glucocorticoid+receptor.hsp90+heterocomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes.</a> Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pifithrin-alpha+inhibits+p53+signaling+after+interaction+of+the+tumor+suppressor+protein+with+hsp90+and+its+nuclear+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation.</a> J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+resolves+two+sequential+ATP-dependent+events+involving+first+hsp70+and+then+hsp90+in+opening+of+the+steroid+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).</li>
<li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+receptor+interactions+with+heat+shock+protein+and+immunophilin+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones.</a> Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).</li>
<li>Bodwell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+phosphorylated+sites+in+the+mouse+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor.</a> J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).</li>
<li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Protein Ubiquitination.</a> J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%26bull%3BHsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&bull;Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM%3A+Immunoprecipitation+Detected+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).</li>
<li>Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functioning+of+the+Hsp90+machine+in+chaperoning+checkpoint+kinase+I+%28Chk1%29+and+the+progesterone+receptor+%28PR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR).</a> Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).</li>
<li>Cintron, N. S., Toft, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+requirements+for+Hsp40+and+Hsp70+in+the+Hsp90+chaperone+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway.</a> J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).</li>
</ol>

電気泳動の試薬を選択して、画像解析ソフトウェアは、Bio - Rad社から提供されました。

上記のアッセイは、hsp90/hsp70-basedシャペロンの機械だけでなく、GRステロイド結合のシャペロンの行動に影響を与える条件の無数をテストするために適応させることができます。それは以前に報告された方法4,8,9,17の修正であり、電気泳動技術の最近の進歩を活用し、より広い研究コミュニティにアクセスできるように設計されています。関心の追加の補助因子やタンパク質は、ステロイド結合、ヘテロ複合体タンパク質 - タンパク質相互作用、および補因子の要件への影響を観察するためにプロトコルのステップ4で説明されているGR•Hsp90のヘテロ複合体の再構成の混合物、、に追加される可能性があります。例えば、HSP90の機能上の虚血 - 再灌流の効果は、活性酸素種の濃度の増加を追加してモデル化することができます。特定の機能（例えば、アセチル化HSP90）または潜在的なHsp90阻害剤（例えば、新規のゲルダナマイシン類縁体）、精製タンパク質が決定されるステロイド結合とヘテロ複合体形成への影響​​のための順序で追加することができます。 ダウンストリームの電気泳動とは異なるア...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> Sf9昆虫細胞</td><td>インビトロジェン</td><td></td><td>組換えマウスのGRのバキュロウイルス発現用</td></tr><tr><td> L929細胞</td><td> ATCC </td><td> CRL - 2173 </td><td>内因性マウスGR細胞質ゾルの調製（バキュロウイルス発現の代替）のための</td></tr><tr><td> FiGRハイブリドーマ細胞</td><td> ATCC </td><td> CRL - 2173 </td><td> （精製BuGR2抗体の代わりに）抗GRモノクローナル抗体を含む腹水を調製するための</td></tr><tr><td>完全なミニプロテアーゼ阻害剤、EDTA -フリー</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td>プロテインA -セファロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギ網状赤血球ライセート</td><td>グリーンエーカー（オレゴン州、ウィスコンシン州） </td><td></td><td>内因性hsp90/hsp70シャペロンの機械の豊富な源</td></tr><tr><td>クレアチンホスホキナーゼ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C3755 </td><td> ATP -再生系のための</td></tr><tr><td>クレアチンリン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P7936 </td><td> ATP -再生系のための</td></tr><tr><td>抗GRのマウスモノクローナル抗体（BuGR2） </td><td>ピアース/サーモサイエンティフィック</td><td> MA1 - 510 </td><td> GR免疫吸着に使用し、ウェスタンブロッティングのような一次抗体</td></tr><tr><td>抗HSP90マウスモノクローナル抗体（AC88） </td><td>エンツォ生命科学</td><td> ADI - SPA - 830 </td><td>ウェスタンブロット法で一次抗体として使用</td></tr><tr><td>抗HSP70マウスモノクローナル抗体（N27F3 - 4） </td><td>エンツォ生命科学</td><td> ADI - SPA - 820 </td><td>ウェスタンブロット法で一次抗体として使用</td></tr><tr><td>マウス血清からのIgG </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 038K7690 </td><td>免疫吸着の負の制御のための非免疫抗体として使用</td></tr><tr><td>抗マウスIgG -ペルオキシダーゼコンジュゲート</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4416 </td><td>ウェスタンブロッティングで二次抗体として使用</td></tr><tr><td> Experionマイクロ流体電気泳動システム</td><td> Bio - Rad社</td><td> 7007001 </td><td>従来のSDS - PAGEの代替</td></tr><tr><td> [1,2,4,6,7 - 3 H]デキサメタゾン</td><td>パーキンエルマー</td><td> NET1192001MC </td><td>安全上の注意に従ってください</td></tr></tbody></table>

ステロイド受容体の生化学的再構成には、•hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90は、細胞周期に関与する転写因子（例えば核内受容体は、p53）およびプロテインキナーゼ（例えば、Srcの、Rafが、Aktキナーゼ）を含む150以上の真核生物のシグナル伝達タンパク質を、調節することが認可されていますが不可欠と非常に豊富な分子シャペロンタンパク質です。腫瘍形成、アポトーシス、および複数の真核生物のシグナル伝達経路の1,2。 HSP90のためのこれらの多くの&quot;クライアント&quot;タンパク質のうち、ステロイド受容体の組み立て•HSP90複合体（ 図1）定義されているベストです。ここでは、順応性グルココルチコイド受容体（GR）免疫沈降アッセイを提示し、容易に真核生物のHSP90の機能的活性、HSP90を介したステロイド受容体のリガンド結合、および分子シャペロンの補因子の要件を調べるために使用される体外 GR•Hsp90の再構築の方法で 。例えば、このアッセイは、Hsp90の補因子の要件と再構成のプロセスに外因性化合物を追加した場合の効果をテストするために使用できます。 受容体はステロイド3にアクセス可能なクレフトオープンリガンドの結合を持つことがHSP90にバインドする必要があるため、GRは、HSP90を研究するための特に有用なシステムとなっています。内因性、リガンド非結合GRは非共有結合的にHSP90に結合した哺乳動物細胞の細胞質に存在​​しています。内因性のGR•Hsp90のヘテロ複合体に見られるように、溝GRのリガンド結合は、オープンと結合ステロイドが可能です。 HSP90 GRから解離し、またはその機能が阻害されている場合、受容体はステロイド結合することができず、ステロイド結合アクティビティの前にGR•HSP90ヘテロ複合体の再構成を必要とする、4を復元している場合。 GRは、モノクローナル抗体を用いて細胞質ゾルから免疫沈降、およびウェスタンブロットによりアッセイすることができるようなHSP90のようなタンパク質は、GRに複合することができます。免疫沈降したGRのステロイド結合活性は[3 H]ステロイドでimmunopelletをインキュベートすることによって決定することができます。 以前の実験では、間隙GRのリガンド結合は、真核細胞の生存にも欠かせない第二の分子シャペロンをHSP70が必要なのHsp90 -介した開口部を示している。 HSP90とHSP70の生化学的活性はコシャペロンタンパク質のホップ、HSP40、およびp23の5によって触媒される。 HSP90、HSP70、ホップ、及びHSP40を含む多タンパク質シャペロンの機械は、真核細胞の細胞質内で内在的に存在し、網状赤血球は、シャペロンの豊富なタンパク質源6が用意されています。 提示方法では、GRは細胞質ゾルからimmunoadsorbedさとマイルドな塩条件を用いて内因性hsp90/hsp70シャペロンの機械を剥奪。塩取り除かれたGRは、網状赤血球ライセート、ATP、およびステロイド結合活性7のGR•Hsp90のヘテロ複合体と再活性化の再構成で、その結果、K +、とインキュベートされる。このメソッドは、8月11日 HSP90を介したステロイド結合にその機能的意義を判断するために、様々なシャペロン補助因子、新規タンパク質、および実験的なHSP90またはGR阻害剤の効果をテストするために利用することができます。

不定冠詞<em&gt; in vitroで</em•HSP90蛋白質複合体蛋白質と細胞のライセートを精製から機能的なグルココルチコイド受容体（GR）を調製するための&gt;方法が記載されている。方法は、塩ストリッパとタンパク質複合体再構成が続く組換えGRの免疫吸着を利用しています。コファクターとバッファーの条件の重要性は、潜在的なメソッドのアプリケーションなので、説明されています。

ステロイド受容体の生化学的再構成には、•Hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化

Hsp90は、必須であり、かつ極めて豊富に存在する分子シャペロンタンパク質であり、150種類以上の真核生物のシグナル伝達タンパク質を調節することが明らかになっています。

この手順の全体的な目的は、ステロイド受容体HSB 90タンパク質複合体を生化学的に再構成し、ステロイド受容体のリガンド結合活性を再活性化させることであり、これによりHSB 90の共因子の必要性や、再構成プロセスに外来化合物を添加した際の影響を検証することができます。これは、まず機能的なグルココルチコイド受容体を含む細胞質を調製することによって達成されます。次に、細胞質からGRを免疫吸着し、内因性のものを除去します。HSP 90が解離します。次に、外来源のHSP 90およびその他のシャペロンタンパク質とコファクターを用いて、GR HSP 90ヘテロ複合体を再構成します。最後に、再構成されたタンパク質複合体とリガンド結合活性を解析します。具体的には、SDS page、ウェスタンブロッティング、および放射性リガンド結合アッセイなどの手法を用いて、GR HSP 90ヘテロ複合体の形成とステロイド結合活性を示します。本手法は、HSP 90の機能的活性を促進するためにどのような共因子シャペロンやCOSシャペロンが必要であるかなど、HSP 90分子シャペロン分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。本手法はタンパク質折り畳みに関する知見を提供できるだけでなく、HSP 90依存的なリード化合物の開発や、HSP 90を必要とする細胞内シグナル伝達経路の解析など、他の系にも適用可能です。本手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室を最近卒業した学生であるHannah FranklinとNathan for AWAの2名です。機能的なグルココルチコイド受容体（GR）を単離するには、対数増殖期にあるマウス線維芽細胞L 9 29細胞、またはリコンビナントGRバキュロウイルスの感染させたSf9細胞を培養します。細胞懸濁液を4 °Cで5,000 ×gにて5分間遠心分離します。得られたペレットの体積は約1〜5 mLになるはずです。細胞ペレットを15 mLのハンクス平衡塩類溶液（HBSS）で3回洗浄します。1 mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含むHEMバッファーと、ダウンストンで50回的に粉砕した3錠の完全ミニプロテアーゼ阻害剤タブレットを含むホモジナイズバッファーを、1.5倍量用意します。ホモジナイザーで細胞を破砕し、タンパク質の分解を防ぐため、この操作は氷上で行いました。ホモジネートを、4 °Cで100,000 Gsにて30分間超遠心分離しました。細胞質を含む上清を、1.5 mLマイクロ遠心チューブに500 µLずつ分注し、-20 °Cで保存しました。受容体特異的GRに対するモノクローナルIgG抗体を含む混合液を調製するには、解凍したGR含有細胞質液100 µL、TEGM緩衝液200 µL、20%タンパク質AセロまたはPASスラリー100 µL、およびbu

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生物学

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