Name: タンパク質の精製で使用するための自動化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムの選択 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学ぶ疎水性相互作用クロマトグラフィーの自動化カラムスカウティング法。中圧液体クロマトグラフィーシステムを用いて、最適なHICカラムと培地を効率的に選定し、再現性の高いタンパク質精製プロトコルを確立する。

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この作品は、健康補助金GM086822と国立科学財団の主要な研究助成金計装DBI-0960313の国立研究所によって資金を供給された。著者は、博士に感謝します。ジョン·三宅＆ドナハーディ（Bio-Rad社）とその技術的専門知識のためにジェニファーLoertscher（シアトル大学）。クロマトグラフィー用試薬を選択し、補足的な計装は、寛大にBio-Rad社によって提供されました。

<ol><li>Cummins, P. M., O'Connor, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interaction+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interaction chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 431-437 (2011).</li>
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</ol>

クロマトグラフィー用試薬を選択し、補足的な計装は、Bio-Radから提供されました。

液体クロマトグラフィー技術は、7生化学的免疫学6を行うために必要な高度に精製したタンパク質、および構造的な8つの研究を準備するために貴重な実証されています。 HICの精製方法は、ほとんどの場合、好ましい培地の経験的判断を必要とし、配位子の構造、リガンド密度、マトリックスビーズのプロパティはすべてのクロマトグラフの結果は2、3に影響を与えることが示されている。スカウト自動化された列は、その後の最適化とタンパク質精製4 HIC培地を選択するための効率的なアプローチである。提示自動化されたカラムスカウティング手法は、容易に様々なHICタンパク質の精製戦略に適合させることができます。塩濃度、塩の選択は、塩勾配、およびpHの変化は、さらに精製条件を向上させることができ、これらの必須のパラメータを変えることの効果は以前に13,14日されています。部分的に精製されたターゲットproteを含むHIC溶出液には、さらに、イオン交換クロマトグラフィー（IEX）またはゲル濾過/サイズ排除クロマトグラフィー9,10などの補完的なクロマトグラフィー技術を用いて精製することができます。 そのユニークな光の吸光度および発光特性の、GFPの溶出プロファイル内の行と、実行後のアプローチを使用して識別することができます。そのために、このプロトコルは、さらに関係のない目的タンパク質がGFPで &quot;タグ付け&quot;されている、組換えGFP融合タンパク質の精製に適応することができます。 GFPタグ付きの標的タンパク質は、UV光11と、上記HIC精製戦略を含む様々なクロマトグラフィー手法を用いて精製して検出することができます。 GFPの精製はまた、近代的な蛋白質科学技術の12の教育のための生化学ラボで教育主食となっています。 基本的なHICタンパク質の精製は、実質的に少ない堅牢なクロマトグラフィーSYを用いて行うことができますが、ステムは、ここで紹介するインストルメンテーションは、良好な結果を得ることを支援するために、異なる多くの利点があります。高度に自動化システムを利用しての顕著な利点は、改善·実行·実行するために条件の再現性、時間を節約し、システム10に導入される空気の機会を減少させたが含まれています。システム·マキシマイザーにより促進されるシステム制御バッファブレンディングは、バッファの準備と実験の再現性に増加した一貫性を可能にします。スカウトは、さらに実行するすべての動的なサンプルループに十分なサンプルの負荷を描画すると、サンプルの均一性は、各列に追加され確保され、中断、または手動でリロードすることなく、順次実行を可能にします。カラムにサンプルループから制御された試料注入は、手動でサンプルロードで発生する可能性がありばらつきが減少します。カラム選択バルブのペアは、それぞれのシステムをreplumbすることなく、異なるHICカラムを使用して、連続したサンプルの実行が可能になります。 MULを実行する<html>ユニークな分光プロファイルを使用して蛋白質を測定する時TI-波長分析では、特に有益です。 GFPに加えて、シトクロム、flavoproteins、および他のヘム含有タンパク質は、この技術の恩恵を受ける可能性があります。伝導度とpHモニタリングデバイスは、リアルタイムの実験条件の検証を可能にします。分割分数溶出コレクションは改善された分画処理を行うことができ、最小限のサンプル量（例えば、ELISA、SDS-PAGE、ウェスタンブロット、とExperionマイクロ流体電気泳動）を必要と実行後の分析手法について簡単に転送できます。第二のフラクションコレクタをオフラインで操作すると手動で同期を必要とするが、それはフラクションコレクタの選択に最大の柔軟性を可能にします。 HICスカウトカラムとタンパク質の精製のためにそのような堅牢なクロマトグラフィーシステムを活用した最も重要な欠点は、楽器の収集とオペレータのトレーニングに関連付けられている最初の時間と予算の支出が含まれています。 T &quot;&gt;ここで紹介するプロトコルは、Bio-Rad社DuoFlowクロマトグラフィーシステムを利用します。。しかし、このようなGEヘルスケアからÄKTAの前衛のような他のメーカーからも同様に堅牢なインストルメンテーションを利用することもできると同等の結果を生成することが可能であっても同等のクロマトグラフィーシステム精製法や楽器の取得を開始する前に考慮すべき固有の特性（例えば、メソッドのプログラミング、コンポーネントの命名法、演算子の優先順位、およびスケーラビリティの制限）があります。

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント（オプション） </td></tr><tr><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">生物学的DuoFlowパスファインダー20システム</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">7602257</a> </td><td>システムマキシマイザー、ミキサー、F10のワークステーション、AVR7-3バルブ、フローセル、BioFracフラクションコレクター、生物学的ソフトウェア、スターターキットを使用QuadTecのUV / VIS検出器を含む</td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">AVR9-8ストリーム選択バルブ</a><html></td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7600408</a> </td><td>生物学的DuoFlowシステムで使用する高圧バルブ、9ポート、8ポジション、3,500 PSI（233バー）の制限、 </td></tr><tr><td>分流弁SV3T-2 </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> 7600410 </td><td>生物学的DuoFlowシステムで使用する電磁弁、3ポート、2ポジション、30 PSI（2バー）の制限、 </td></tr><tr><td>ストリームスプリッタバルブ</td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>tical = LSR＆parentCategoryGUID = 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; DynaLoop 25キット</td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0451&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7500451</a> </td><td>スライディングピストンサンプルループ·キット、25ミリリットルのDynaLoopスライディングピストンループ、DynaLoop部品キット（＃750から0450まで）が含まれています</td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">BioFracフラクションコレクタ</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">7410002</a> </td><td>二つの分数COL<html>使用lectors </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">BioFracマイクロドロップヘッドアダプタ</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">7410088</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&vertical=LSR&country=US&lang=en&productID=741-0017" target="_blank">BioFracマイクロタイタープレートアダプタ</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td>＆国=米国＆LANG = EN＆ProductID =に741-0017 &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; 7410017 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">UV光モジュール</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">7500202</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-1331&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c4095dc1-9260-4431-b066-823b050048c8" target="_blank">ハロゲンランプ</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> &lt;<html> 1ターゲット= &quot;_blank&quot;&gt; 7601331 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">エコノグラジエントポンプ</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">7319001</a> </td><td>低圧タンパク質精製のための勾配ポンプは、チューブと継手キットが含まれています</td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224301" target="_blank">Experionシステム</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td>bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad？CMD = BRCatgProductDetail＆ProductID =に224301 &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; 7007001 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">Experion Pro260分析キット</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">バイオ·ラッド</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">7007102</a> </td><td></td></tr><tr><td>ハイトラップHICカラム選択キット</td><td> GEヘルスケア</td><td> 28-4110-07 </td><td>スカウトのためにHICのメディアの7×1ミリリットルプレパックドカラムが含まれています</td></tr><tr><td> GEヘルスケア·ツー·Bio-Rad社のカラムフィッティング</td><td> GEヘルスケア</td><td> 18111251と18111257 </td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質の精製で使用するための自​​動化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムの選択

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

精製タンパク質（例えば、ゲル濾過、アフィニティー、イオン交換）用の他のクロマトグラフィー法とは対照的に、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）は、一般に最も適したクロマトグラフ媒体を選択するために実験的な決定を（スクリーニングまたは &quot;スカウト&quot;と呼ばれる）が必要です与えられたタンパク質1を精製する 。ここで紹介する方法は、タンパク質精製に使用する最適なHICメディアのスカウトへの自動アプローチを説明します。 HICは、疎水性の差に基づいて粗ライセートからタンパク質などの生体分子を分離しています。アフィニティークロマトグラフィー（AC）とイオン交換クロマトグラフィー（IEX）と同様に、HICは、クロマトグラフィープロセスの進行に応じて、目的のタンパク質を濃縮することができます。最高のHICによる精製に適したタンパク質は、疎水性表面領域を有するものが含まれており、2 Mの弾薬を超える濃度の塩への暴露に耐えることができるnium硫酸塩（（NH 4）2 SO 4）。 HICは、多くの場合、アフィニティタグを欠いているタンパク質の精製法として選択し、ACのため、適さない、とIEXは、十分な精製を提供するために失敗したときにされています。タンパク質表面の疎水性部分は、一時的に不活性、不動のマトリックスに結合された非極性リガンドに結合する。タンパク質とリガンドとの相互作用は、タンパク質-リガンド相互作用を強化し、不動のタンパク質（すなわち、列の内側に結合した2）を作る高イオン濃度で、クロマトグラフィーカラムを通過する緩衝液の塩濃度に大きく依存します。塩濃度が低下すると、タンパク質 - リガンド相互作用は消費電力、タンパク質は再び携帯電話になり、カラムから溶出する。 HIC複数の媒体がプリパックドカラムで市販されている、複数の疎水リガンド（例えばオクチルs-ブチル、ブチルおよびフェニル）のそれぞれ含むものには規格のアガロースビーズに濃度を変化させて架橋タイプIFIC直径3。 HICメディアが将来、より徹底的な最適化の実験やタンパク質精製の ​​ために採用すべきかを決定するための効率的なアプローチは、4を実行するためにスカウト自動化された列ができます。 ここで精製されている特定のタンパク質は、組換え緑色蛍光タンパク質（GFP）であるが、アプローチは、1つまたは複数の疎水性表面領域と他のタンパク質を精製するために適合させることができる。 GFPは紫外線を5にさらされたとき、その安定性、397 nmでのユニークな吸光度のピークと蛍光による有用なモデルタンパク質として機能します。野生型GFPを含む細菌ライセートは、高塩緩衝液中に調製Bio-Rad社DuoFlow媒体圧力液体クロマトグラフィーシステムにロードされ、異なるHICメディアを含むハイトラップHICカラムに吸着させた。タンパク質はカラムから溶出し、内の行と、実行後の検出法によって分析した。バッファ·ブレンディング、動的なサンプルループ注入、シーケンシャルCOLUMN選択、マルチ波長分析、分割割合溶出コレクションは、実験的アプローチのシステムおよび再現性の機能を増加した。

タンパク質精製のプロセスで使用される適切な疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）メディアを識別するための自​​動化された方法が示されています。メソッドは、自動化されたバッファ·ブレンディング、動的なサンプルループ注入、順次列の選択、マルチ波長分析、分割割合溶出コレクションなどの中圧液体クロマトグラフィーシステムを利用しています。

タンパク質精製のための他のクロマトグラフィー法（例：ゲルろ過、アフィニティー、イオン交換）とは対照的に、疎水性相互作用...

本手順の全体的な目的は、BioRad DUO flow 中圧液体クロマトグラフィーシステムを用い、自動スカウティング法によって、リコンビナントタンパク質の精製に最適なHI液体クロマトグラフィーカラムを選定することです。まず、必要なバッファーおよび目的のリコンビナントタンパク質を含む細菌ライセートを調製します。次に、duo flow クロマトグラフィーシステムの物理的な設置と配管を行い、スカウティングプロトコルの準備を整えます。次に、サンプルをロードし、プログラムされたHIカラムスクリーニング法を実行して、分画サンプルEITを回収します。最後に、EITを分析し、観察された分離特性に基づいて最適なHIカラムおよび充填剤を特定します。最終的に、DUO flow自動HIカラムスクリーニング機能を用いた中圧液体クロマトグラフィーによる目的タンパク質のスケールアップ精製に最適なHIカラム充填剤を示す結果を得ることができます。手動のカラムクロマトグラフィーを連続的に行うなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、プロセスを自動化することで変動が抑えられ、再現性の高い結果が保証されることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、現代の液体クロマトグラフィーシステムの物理的な複雑さから困難を感じる場合がありますが、これらは容易に習得可能です。十分な練習の後、本手順のデモンストレーションを私の研究室の学生であるOrange StoneとShelly Andersonが行います。まず、以下のバッファーを500 mLずつ準備します。バッファーA1用として200 mMリン酸ナトリウム、バッファーA2用として200 mMリン酸水素ナトリウム、そしてバッファーB2用として4.8 M硫酸アンモニウムです。バッファーB1には脱イオン水を使用します。最適なクロマトグラフィー動作条件を確保するため、各バッファーを脱気してください。システムマキシマイザーがバッファーA1とA2を混合して低塩濃度リン酸溶出バッファーを生成し、バッファーB1とB2を混合して高塩濃度硫酸アンモニウムバッファーを生成します。スタートバッファー。精製対象のタンパク質を含む細胞溶解液 10 milliliters とバッファーB 2を 10 milliliters 混合し、ロード用のサンプル 20 milliliters を調製します。細胞溶解液サンプル溶液の最終的な硫酸アンモニウム濃度は約 2.4 molar となり、スタートバッファーとほぼ同等になります。溶液から粒子状物質を除去するため、溶解バッファー混合液を低タンパク結合性の0.45 µmシリンジフィルターでろ過します。システムにロードするまで、サンプルは氷上で保持してください。クロマトグラフィーシステムの物理的なセットアップと配管は、この手順の中で最も複雑な工程の一つです。ここに示す図に従って、デュオフロークロマトグラフィーシステムをセットアップします。プロトコル全体を通じて十分な量のバッファーが確保されており、チューブが常に浸漬した状態にあることを確認してください。ここに示されるようにサンプルロードバルブとダイナミックサンプルループを配管し、サンプルループをポジション3のサンプルバルブ入口に接続します。外径1/16インチのピークチューブを、同じ長さのペアで8組用意します。次に、これらのペアを2つのカラム選択バルブのポジション1から8に接続します。UV検出器のランプを点灯させ、すべての検出器が校正されていることを確認した後、図に示すようにフラクションコレクターのストリームスプリッターバルブとスプリッターコントローラーを取り付けます。ポジション2のフラクションコレクター・スプリッターバルブおよびスプリッターコントローラーは、クロマトグラフィーワークステーションとは独立して操作します。分取比率（percent split）を10に設定してください。ポジション2のフラクションコレクターに取り付けられている標準的なドロップヘッドを、マイクロプレート用ドロップヘッドに交換します。サンプルループをすすぎ、クロマトグラフィーシステムをフラッシュします。次に、溶出バッファーを1 mL/minの速度でシステム内に手動で流し始めます。High Trap HIカラム（1 mL）をカラム選択バルブの2番から8番のポジションに接続します。ポジション2のカラム選択バルブを接続しているユニオンを取り外します。上流側のカラムフィッティングをデュオフローに取り付けます。空気がすべて抜け、大きな緩衝液の滴が現れるまで、溶出緩衝液をフィッティングに通します。次に、カラム入口に接続されているストッパーを取り外し、低塩濃度バッファーを多めにカラム上部に滴下します。その後、カラムを上流側のフィッティングに取り付けます。出口側を、下流側のカラムフィッティングおよび選択バルブチューブに接続します。背圧制限を40 PS.Iに設定します。流速1 mL/minで、カラム体積の5倍量（5 CV）の溶出バッファーを用いてカラムを洗浄します。続いて、流速1 mL/minで、カラム体積の10倍量（10 CV）の開始バッファーを用いてカラムを洗浄します。pH、UVトレーシング、および背圧が安定したら、カラム選択バルブを手動でポジション1に切り替え、バッファーの流れを停止させます。サンプルをロードするには、サンプル導入チューブを20 milliliterのサンプルに浸します。その後、サンプルループロード洗浄バルブをポジション1に、サンプルロードバルブをパージに切り替えます。サンプルループ充填ポンプを作動させ、サンプルがサンプル充填バルブに到達した直後まで、1 mL/minの流量でサンプルをポンプチューブ内に吸引します。サンプル充填バルブをパージ（purge）からロード（load）に切り替えます。バイオロジックソフトウェアのセットアップウィンドウから、サンプルループに10 mLのサンプルが吸引されるまで、サンプルループ充填ポンプを1 mL/minの流量で再始動させます。本表でアスタリスクが付いているシステムデバイスを選択してください。次に、アッセイプログラムに使用するHICカラムを6本選択します。線形降下塩濃度勾配および6カラムスカウティングメソッドにより、開始バッファーの流量を1 mL/minで手動で開始します。スプリッターコントローラーのスタートボタンを押し、90%から10%へのEITストリーム分割を開始します。プログラムメソッドのランを開始した直後に、オフライン96ウェルプレート分画回収機のオンスクリーンコントロールパネルでスタートボタンを押してください。リアルタイムディスプレイを確認し、想定されるランパラメータであることを確かめます。GFP特異的な397 nanometerの吸光度トレーシングを、一般的なタンパク質の280 nanometerの吸光度トレーシングと比較し、スクリーニング中の異なるHI培地を用いた相対的な分離および精製度を推定します。96ウェルプレート分画から5 to 50 µLのアリコートを新しいプレートに移し、ELISAまたはウェスタンブロットで特異的タンパク質含有量を、SDS-PAGEまたはExperianマイクロ流体電気泳動システムで全タンパク質含有量を分析できます。ここに、スクリーニングランにおける代表的な塩濃度勾配導電率およびカラム圧を示します。高塩濃度バッファーラインから吸引されるバッファーの割合で測定される塩濃度の変化は、HI法の典型的な特徴です。塩濃度が低下するにつれて、カラムに結合していたタンパク質が溶出します。導電率（観測される塩濃度に相当）は、quad techおよびUV検出器の直後のラインで測定されます。塩濃度勾配と導電率チャートの間のオフセットは、バッファーがバッファー入口からシステムを経由して導電率モニターに到達するまでに要する時間を示しています。サンプルのラン中、システム圧力とpHは比較的一定に保たれます。この図は、全タンパク質のインライン検出による一連のHIカラムスカウティングランのクロマトグラムを示しています。NGFPは、それぞれ280 nanometersと397 nanometersにおける光の吸光度を測定することで達成されます。各スカウティングランにおけるGFPの相対的な量と分離を概算することが可能です。この図の2つのラインを比較すると、フェンネルFFスカウティングランの画分10、12、14、16、および18の培養チューブを、周囲光または蛍光灯の下、および紫外線管の下で正面と上方の両方向から観察し、特徴的なGFP発光スペクトルを確認したところ、画分14においてGFPが明確に検出されました。いずれのUV画像においても、左側のUVパネルに見られる拡散した青色はUVランプから放出された光です。これらのラン後のデータは、397 nmでの溶出液の吸光度測定によるGFPのインライン検出結果とよく一致しており、分画14に溶出GFPのメインピークが含まれていることが示されています。本手順に続き、精製したタンパク質の純度や機能的活性に関するさらなる疑問を解消するために、ウェスタンブロッティング、ELISA、原子間力顕微鏡（AFM）、生化学的再構成アッセイなどの他の手法を実施することが可能です。この手順を実施する際は、メソッド内のいくつかの時点でデュアルフローシステムを手動で制御する必要があることに留意してください。具体例としては、バッファーの補充やサンプルのロード、気泡の確認、および必要に応じた検出ランプのオン・オフ操作などが挙げられます。このビデオを視聴することで、液体クロマトグラフィーシステムを用いて、最適なHIカラムおよび担体の自動スカウティングを行う方法について十分に理解できるはずです。インラインおよびポスターによる評価分析を行うことで、研究者はその後のスケールアップ精製に適したカラムを選択することができ、また、標的タンパク質の純度と収量を向上させるために他のクロマトグラフィー法と組み合わせることも可能です。

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Research

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Biology

生物学

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マルチカラムプレートアダプタを用いた経済的で多用途の高スループットタンパク質精製システム

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の精製 M. magneticum株AMB - 1 Magnetosome関連タンパク質MamAΔ41

学ぶ疎水性相互作用クロマトグラフィーの自動化カラムスカウティング法。中圧液体クロマトグラフィーシステムを用いて、最適なHICカラムと培地を効率的に選定し、再現性の高いタンパク質精製プロトコルを確立する。

タンパク質の精製で使用するための自​​動化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムの選択

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