タンパク質の精製で使用するための自​​動化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムの選択

この手順の全体的な目的は、BioRad DUO flow中圧液体クロマトグラフィーシステムを用い、自動スカウティング法によって組み換えタンパク質の精製に最適なHI液体クロマトグラフィーカラムを選定することです。まず、必要なバッファーおよび目的の組み換えタンパク質を含む細菌ライセートを調製します。次に、duo flowクロマトグラフィーシステムの物理的なセットアップと配管を行い、スカウティングプロトコルの準備を整えます。

次にサンプルをロードし、プログラムされたHIカラムスカウティング法を実行して分画サンプルのEITを回収します。最後に、EITを分析し、観察された分離特性に基づいて最適なHIカラムと担体を特定します。最終的に、DUO flowの自動HIカラムスカウティング機能を用いた中圧液体クロマトグラフィーにより、研究者が目的とするタンパク質のスケールアップ精製に適したHIカラム担体を決定することが可能です。

手動カラムクロマトグラフィーの連続的な実行などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、プロセスを自動化することでばらつきが減少し、再現性の高い結果が保証されることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、現代の液体クロマトグラフィーシステムの物理的な複雑さから苦労することがありますが、これは容易に習得可能です。

十分な練習の後、プロトコルの実演を私の研究室の学生であるOrange StoneとShelly Andersonが行います。まず、以下のバッファーを500 milliliters用意してください。バッファーA1用に200 millimolar リン酸ナトリウム、バッファーA2用に200 millimolar リン酸水素ナトリウム、およびバッファーB2用に4.8 molar 硫酸アンモニウムです。バッファーB1には脱イオン水を使用します。最適なクロマトグラフィー動作条件を確保するため、各バッファーを脱気してください。システムマキシマイザーがバッファーA1とA2を混合して低塩濃度のリン酸溶出バッファーを生成し、バッファーB1とB2を混合して高塩濃度の硫酸アンモニウムバッファーを生成します。

スタートバッファー。精製対象のタンパク質を含む細胞溶解液 10 milliliters と、バッファーB2 10 milliliters を混合し、ロード用のサンプル 20 milliliters を調製します。細胞溶解液サンプル溶液の最終硫酸アンモニウム濃度を約 2.4 molar にすることで、スタートバッファーとほぼ同等にします。

溶液から粒子状物質を除去するため、ライセートバッファー混合液を低タンパク結合性の0.45 µmシリンジフィルターでろ過します。システムにロードするまで、サンプルは氷上で保持してください。クロマトグラフィーシステムの物理的なセットアップと配管は、本手順において最も複雑な工程の一つです。

ここに示す図に従って、デュオフロークロマトグラフィーシステムをセットアップします。プロトコル全体を通じて十分な量のバッファーが確保されていること、およびチューブが常に液中に浸かっていることを確認してください。ここに図示されているように、サンプルロードバルブとダイナミックサンプルループを配管し、サンプルループをポジション3のサンプルバルブ入口に接続します。

外径1/16インチのピークチューブを、同じ長さのペアで8組用意します。次に、これらのペアを2つのカラム選択バルブの1番から8番のポジションに接続します。UV検出器のランプを点灯させ、すべての検出器が校正されていることを確認した後、図に示すように分画コレクターのストリームスプリッターバルブとスプリッターコントローラーを取り付けます。

ポジション2のフラクションコレクターのスプリッターバルブおよびスプリッターコントローラーは、クロマトグラフィーワークステーションからオフラインで操作します。分取率（percent split）を10%に設定してください。ポジション2のフラクションコレクターにある標準のドロップヘッドを、マイクロプレート用ドロップヘッドに交換します。

サンプルループを洗浄し、クロマトグラフィーシステムをフラッシュします。次に、溶出バッファーを1 mL/minの流速で手動でシステムに流します。1 mL High Trap HIカラムを、カラム選択バルブのポジション2から8に接続します。

ポジション2のカラム選択バルブを接続しているユニオンを取り除きます。上流側のカラムフィッティングをデュオフローに取り付けます。空気がすべて抜け、大きな液滴が形成されるまで、溶出バッファーをフィッティングに通します。

次に、カラム入口に接続されているストッパーを取り外し、低塩濃度バッファーをカラム上部に大きく1滴滴下します。その後、カラムを上流側のフィッティングに接続します。出口を下流側のカラムフィッティングおよび選択バルブチューブに接続します。

背圧制限を40 PS.Iに設定します。流速1 mL/minで、カラム容積の5倍量の溶出バッファーを用いてカラムを洗浄します。次いで、流速1 mL/minで、カラム容積の10倍量の開始バッファーを用いてカラムを洗浄します。

pH、UVトレース、および背圧が安定したら、カラム選択バルブを手動でポジション1に切り替え、バッファーの流れを停止させます。サンプルをロードするには、サンプル導入チューブを20 milliliterのサンプルに浸します。次に、サンプルループロード洗浄バルブをポジション1に、サンプルロードバルブをパージに切り替えます。

サンプルループ充填ポンプを作動させ、サンプルがサンプル充填バルブに到達した直後まで、1 mL/minの流速でサンプルをポンプチューブ内に吸引します。サンプル充填バルブをパージ（purge）からロード（load）に切り替えます。バイオロジックソフトウェアのセットアップウィンドウから、ダイナミックサンプルループに10 mLのサンプルが吸引されるまで、1 mL/minの流速でサンプルループ充填ポンプを再始動させます。

本表でアスタリスクが付いているシステムデバイスを選択してください。次に、アッセイプログラムに使用するHICカラムを6本選択します。線形降下塩濃度勾配および6カラムのスカウティングメソッドにより、開始バッファーの流量を1 mL/minで手動的に開始させます。

スプリッターコントローラーのスタートボタンを押し、90%から10%へのEITストリーム分割を開始します。プログラムメソッドのランを開始した直後に、オフライン96ウェルプレート分画コレクターの画面上のコントロールパネルでスタートボタンを押してください。リアルタイムディスプレイを確認し、期待されるランパラメータであることを確認します。GFP特異的な397 nanometerの吸光度トレーシングを、一般的なタンパク質の280 nanometerの吸光度トレーシングと比較し、検討中の異なるHIメディアを用いた相対的な分離および精製度を推定します。96ウェルプレート分画から5 to 50 µLのアリコートを新しいプレートに分注し、ELISAまたはウェスタンブロットで特定のタンパク質含量を、SDS-PAGEまたはExperianマイクロ流体電気泳動システムで全タンパク質含量をアッセイすることができます。ここに、スクーティングランの代表的なhick塩濃度勾配導電率およびカラム圧を示します。

高塩濃度バッファーラインから導入されたバッファーの割合によって測定される塩濃度の変化は、HI法の典型的な手法です。塩濃度が低下するにつれて、カラムに結合していたタンパク質が溶出します。観測される塩濃度に対応する導電率は、quad techおよびUV検出器の直後でインライン測定されます。塩濃度勾配と導電率トレースの間のオフセットは、バッファーが導入口からシステムを経由して導電率モニターに到達するまでに要する時間を示しています。

サンプルのラン中、システム圧力とpHは比較的一定に保たれます。この図は、全タンパク質のインライン検出を行った連続的なHIカラムスカウティングランのクロマトグラムを示しています。NGFPは、それぞれ280 nanometersおよび397 nanometersにおける光の吸光度を測定することで達成されます。

各スカウティングランにおけるGFPの相対的な存在量と分離度を概算することが可能です。この図の2本のラインを比較すると、フェンネルFFスカウティングランの分画10、12、14、16、および18の培養管を、周囲光または蛍光灯の下、および紫外線管の下で正面および上面から観察して特徴的なGFP放出スペクトルを確認したところ、分画14においてGFPが明確に検出されました。両方のUV画像において、左側のUVパネルに見られる拡散した青色は、UVランプから放出された光です。

これらのラン後のデータは、397 nmでの溶出液の吸光度測定によるGFPのインライン検出結果と良好に一致しており、分画14に溶出したGFPの主要なピークが含まれていることが示されました。この手順に続き、精製したタンパク質の純度や機能活性に関するさらなる疑問を解消するために、ウェスタンブロッティング、ELISA、原子間力顕微鏡、生化学的再構成アッセイなどの他の手法を実施することが可能です。

この手順を実施する際は、メソッド内のいくつかの段階でデュアルフローシステムを手動で制御する必要があることに留意することが重要です。具体例としては、バッファーの補充やサンプルのロード、気泡の有無の確認、および必要に応じた検出ランプのオン・オフ操作などが挙げられます。このビデオを視聴することで、液体クロマトグラフィーシステムを用いて、最適なHIカラムおよび担体の自動スカウティングを行う方法について十分に理解できるはずです。

インラインおよびポスターによる評価分析を行うことで、研究者はその後のスケールアップ精製に適したカラムを選択でき、さらに他のクロマトグラフィー法と組み合わせることで、標的タンパク質の純度と収率を向上させることが可能になります。