マウスの仔脳からのミクログリアの磁気分離

ミクログリア(脳に常在するマクロファージ)は、細胞表面インテグリンであるCD11bを発現します。

マウスの子犬の脳からミクログリアを単離するには、タンパク質分解酵素であるパパインとデオキシリボヌクレアーゼを含む緩衝液を含む解離チューブに大脳断片を取ります。

チューブを機械的解離器の上に置きます。実行中、解離剤は組織を機械的に破壊します。

パパインは組織の細胞外マトリックスを消化し、ミクログリアを含む細胞を懸濁液に放出します。デオキシリボヌクレアーゼは懸濁液中の遊離DNAを分解し、非効率的な細胞単離を防ぎます。

遠心機。ピペッティングによって機械的解離を完了します。懸濁液を細胞ストレーナーに通して破片や細胞塊を除去し、均質な単一細胞集団を得る。

抗CD11b抗体で官能化した超常磁性マイクロビーズでインキュベートします。マイクロビーズは、ミクログリアを含む細胞上のCD11bに特異的に結合します。

インキュベーション後、遠心分離機。結合していないビーズを含む上清を取り除きます。細胞をバッファーに再懸濁します。磁気分離器に置かれたカラムに荷重をかけます。カラムは、強磁性ビーズを含むマトリックスで構成されています。

セパレーターに置くと、カラム内の球体が磁場を増幅し、マイクロビーズに結合したCD11b+細胞をカラム内に保持し、他の細胞が流れます。

セパレーターから取り出し、バッファーを使用してカラムからCD11b+細胞を溶出します。懸濁液を遠心分離し、CD11b+細胞をミクログリア培地に再懸濁します。

単

離された細胞は、さらなる分析の準備が整います。

この表に従って解離混合物を調製します。12個の脳片をCチューブに移し、解離チューブあたり1.2グラムの総重量を実現します。次に、加熱しながらCチューブを解離器に置きます。最適化されたNTDKプログラムを解離器で起動します。遠心分離機を20秒間離します。ピペッティングを3回行い、機械的解離を完了します。

細胞をストレーナーが取り付けられた4本の15ミリリットルチューブに移します。ストレーナーをカルシウムとマグネシウムを含む10ミリリットルのHBSSですすいでください。10分間遠心分離し、10ミリリットルのピペットで上清を取り除きます。慎重に、カルシウムとマグネシウムを含む10ミリリットルのHBSSを加え、ペレットを再懸濁します。再び、遠心分離して上清を除去します。

ペレットを6ミリリットルの選別バッファーで再懸濁します。遠心分離を繰り返し、上清を廃棄します。次に、200マイクロリットルのCD11b-マイクロビーズ溶液を加え、チューブを摂氏4度で15〜20分間インキュベートします。インキュベーション後、ペレットを6ミリリットルの選別バッファーで再懸濁します。遠心分離を繰り返し、ペレットを8ミリリットルの選別バッファーで再懸濁します。

次に、セパレーターのPOSSELプログラムに従って、8つの列を準備します。一度に1ミリリットルの細胞懸濁液を加えて、細胞をカラムに通します。1ミリリットルの選別バッファーを使用して、無菌溶出プレート上でCD11b陽性細胞を溶出します。細胞を50ミリリットルのチューブにプールします。

ペ

レットを遠心分離し、10ミリリットルの冷たいミクログリア培地で再懸濁します。CD11b陽性細胞を数えます。細胞を低温ミクログリア培地に再懸濁して、1ミリリットルあたり650,000〜700,000細胞の最終濃度を得る。