0 閲覧数 • 4:29 分 • July 8th, 2025
好中球(細菌の除去を促進する必須免疫細胞)の動員を監視するには、背中の結合組織を露出させる傷を持つ麻酔をかけたトランスジェニック免疫不全マウスから始めます。
トランスジェニックマウスの好中球は、好中球の追跡を促進する強化された緑色蛍光タンパク質を発現します。さらに、細菌を殺す能力が損なわれているため、マウスは感染しやすくなります。
生物発光(発光特性)を持つ遺伝子組み換え細菌接種剤を考えてみましょう。
細菌接種物を損傷部位に注射し、結合組織と筋膜 (結合組織の下の線維組織層) の間に確実に送達します。注射部位では、細菌が増殖してコロニーを形成し、組織感染を引き起こします。
感染に反応して、免疫細胞はケモカイン(好中球を引き付ける化学シグナル伝達分子)を放出します。好中球は走化性(化学誘発性運動)を介して急速に移動し、血管を通って細菌感染の近くの組織に血管外漏出します。
生物発光と蛍光シグナルをマウスに画像化し、それぞれ細菌負荷と動員された好中球
を表します。時間の経過とともに、生物発光および蛍光シグナルの増加は、細菌負荷の増加と感染部位での継続的な好中球動員と相関します。
黄色ブドウ球菌接種の場合は、28ゲージのインスリン注射器に50マイクロリットルの調製した生物発光細菌接種剤を充填し、指を使って負傷した動物の真皮を横に引っ張ります。注射器を組織とほぼ平行に持ち、筋膜のピアスを示す抵抗の急激な減少が感じられるまで、注射器をゆっくりと組織に挿入します。
針を傷の中央に置き、接種剤の全量をゆっくりと送ります。接種剤が傷口の中心に漏れや分散を最小限に抑えて気泡を形成していることを確認し、注射器を動物からゆっくりと取り出します。次に、完全に回復するまで、熱と監視で動物をケージに戻します。
傷や感染の後、そして実験中は毎日、麻酔をかけたマウスを創傷をできるだけ平らにして生物発光および蛍光イメージャーに入れます。イメージャーソフトウェアで、イメージングモードとして[ルミネセンス]と[写真]を選択します。露光時間は、小さなビニングで1分、発光の場合はF/ストップ1、写真の場合はF/ストップ8、発光フィルターの場合はオープンにプリセットする必要があります。次に、「取得」をクリックして画像を記録します。
in vivo蛍光イメージングの場合は、イメージングモードとして蛍光と写真を選択します。露光時間は、スモールビニングで1秒、蛍光でF/ストップ1、写真でF/ストップ8、励起波長と発光波長をそれぞれ30ナノメートル以上465、20ナノメートル以上520にあらかじめ設定する必要があります。次に、「取得」をクリックして画像を記録します。
両方の画像セットを取得した後、完全に回復するまで監視しながら動物をケージに戻します。
画像解析の場合は、適切な画像解析ソフトウェアプログラムで定量化する画像を開き、周囲の皮膚を含む創傷領域全体にデフォルトの円形の関心領域を配置します。[関心領域の測定]をクリックし、創傷の平均フラックスの値を記録して、各信号の平均フラックスを時間に対してプロットできるようにします。
創傷治癒を測定するには、創傷の端に関心のある円形の領域をはめ込み、創傷の面積をセンチメートルの二乗で測定して、ベースラインと時間からの分数変化をプロットできるようにします。