抗体に応答したマウス骨髄由来マクロファージの活性化

病原体への曝露後、マクロファージは活性化され、炎症誘発性および抗炎症性サイトカインを放出し、免疫系の反応を調整します。

骨髄由来マクロファージの活性化をin vitroで研究するには、単離したマウス骨髄細胞懸濁液を培養フラスコに移します。短時間インキュベートします。

間葉系細胞、単球、および成熟マクロファージはフラスコ表面に付着し、造血前駆細胞は懸濁液のままです。

血前駆細胞を含む培地を収集し、遠心分離します。マクロファージコロニー刺激因子、M-CSF培地に再懸濁した細胞を培養フラスコに移します。

M-CSFは骨髄前駆細胞亜集団をマクロファージに分化させ、マクロファージは分岐してフラスコに付着しているように見えます。

非接着性細胞含有培地を廃棄します。M-CSF培地を加え、インキュベートします。マクロファージが完全に機能した状態に達したら、それらを収穫します。遠心機。

プレートマクロファージをM-CSF培地に再懸濁してマルチウェルプレートウェルに再懸濁します。ウェルへのマクロファージの付着に続いて、ヒトポリクローナル免疫グロブリンと毒素である細菌リポ多糖類(LPS)を追加します。

免疫グロブリンは特定のFCγ受容体に結合し、LPSはマクロファージ上のToll様受容体に結合します。この共刺激は、下流のシグナル伝達カスケードを介して抗炎症性マクロファージの活性化を促進し、高レベルの抗炎症性サイトカインと低レベルの炎症誘発性サイトカインの放出を引き起こします。

サイトカイン含有培地を採取して、マクロファージの活性化を確認するためのさらなる分析を行います。

安楽死させたマウスを手足を伸ばした状態で発泡ボードに仰臥位で固定し、70%エタノールで脚を洗浄します。次に、深さ約2ミリメートルの浅い切り込みを入れて、各後ろ足の表面から皮膚と毛皮を取り除きます。次に、組織を解剖して脛骨と大腿骨にアクセスします。

脛骨と大腿骨を取り除くには、股関節のすぐ下と足首の上の骨と筋肉を切断します。次に、骨からできるだけ多くの筋肉組織を取り除きます。次に、骨を70%エタノールで洗浄し、1分間蒸発させてから、骨フラッシュ培地で満たされた6ウェルプレートに骨を入れます。

プレートで、大腿骨の両端から1ミリメートルトリミングして、大腿骨の内腔が露出するようにします。26ゲージの針が空洞にアクセスできることを確認してください。次に、脛骨と大腿骨を膝関節から分離します。次に、10ミリリットルの注射器に取り付けられた針を骨腔に挿入し、骨髄を採取します。

4つの骨すべてから骨髄を50ミリリットルの骨フラッシュ培地を入れた50ミリリットルの円錐形のチューブにプールします。培地と骨髄を上下に数回ピペットで移動させるか、低速でボルテックスして懸濁液内の塊を穏やかに分散させます。骨髄の糸は、長さ半ミリメートル未満の骨髄の小さな斑点に分割する必要があります。

次に、チューブに骨フラッシュ培地を50ミリリットルまで補充し、75平方センチメートルの組織培養フラスコに移します。骨髄を1時間インキュベートします。インキュベーション中、成熟した細胞はフラスコに付着し、目的の造血前駆細胞は懸濁液のままになります。懸濁液を50ミリリットルの円錐形チューブに移し、細胞をペレットにスピンダウンします。

次に、上清を廃棄し、細胞ペレットを5ミリリットルのMCSF培地に再懸濁します。次に、セル密度を1ミリリットルあたり500,000に調整し、新しい75平方センチメートルのフラスコに30ミリリットルをロードします。細胞の培養を続け、4日目、7日目、10日目に、細胞が接着し、逆位相差明視野顕微鏡を使用してわずかに分岐していることを確認します。

細胞をチェックするときは、非接着細胞を含む培地を廃棄します。次に、接着細胞をIMDMで1回洗浄し、30ミリリットルの新鮮なMSCF培地をフラスコに戻します。10日目に、培地を8ミリリットルの酵素フリーEDTAベースの細胞解離バッファーに交換して、細胞を収集します。細胞を短時間インキュベートしてから、細胞をそっとこすり落とし、顕微鏡を使用して細胞が放出したことを確認します。

細胞が放出されたら、細胞を含むバッファーを50ミリリットルの円錐形チューブに移し、フラスコを5ミリリットルのIMDMで3回すすぎ、より多くの細胞を収集します。すべてのコレクションをプールし、遠心分離し、ペレットを3ミリリットルのMCSFに再懸濁します。次に、細胞を数え、濃度を1ミリリットルあたり100万に調整します。

次に、96ウェルの平底プレートにウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液をプレートします。プレート全体が充填可能である必要があります。細胞が付着するまで約1時間培養します。次に、IMDMで調製された異なる濃度のLPSまたは静脈内免疫グロブリン、またはその両方でそれらを刺激します。すべての操作を複製または3回実行し、未処理のコントロールを確実に保持してから、細胞を24時間インキュベートし、上清を分析します。