マウスモデルにおける細菌感染に対するワクチン誘導性免疫の評価

ワクチン誘発性免疫を研究するには、無細胞百日咳ワクチンを充填した注射を服用します。このワクチンには、呼吸器疾患の原因となる細菌である百日咳ボルデテラの抗原タンパク質と、持続的な免疫応答のために抗原曝露を延長するアジュバントが含まれています。

麻酔をかけたマウスにワクチンを筋肉内注射します。

注射後、常在抗原提示細胞であるAPCは、抗原タンパク質を捕捉してペプチドに処理し、表面に提示します。これらの APC は近くのリンパ節に移動し、T 細胞と相互作用し、活性化とエフェクター T 細胞への分化を開始します。

これらのエフェクター T 細胞は循環して肺を含むさまざまな臓器に移動し、そこで常在メモリー T 細胞または T_RM 細胞として存在し、免疫につながります。

予防接種後、生きた百日咳ボルデテラの抗生物質耐性株を鼻腔内に投与します。これらの細菌は肺組織に入り、T_RM 細胞を活性化します。活性化された T_RM 細胞は、免疫細胞を動員して細菌のクリアランスを引き起こす炎症性サイトカインを分泌します。

マウスの肺組織を採取し、均質化して単一細胞懸濁液を得る。希釈した細胞懸濁液を抗生物質を含む寒天プレートに広げ、インキュベートして細菌コロニーを形成できるようにします。

免疫化されたマウスからの組織抽出物は、免疫されていないマウスからの組織抽出物と比較してコロニーが少なく、百日咳ボルデテラに対するワクチン誘発性免疫が確認されています。

予防接種のために、麻酔をかけた6〜12週齢のマウスのつま先ピンチに対する反応の欠如を確認し、28.5ゲージの針を備えた1ミリリットルのインスリン注射器に0.1ミリリットルの目的のワクチンを装填します。ベベルを上に向けてシリンジを45度の角度で持ち、マウスの三角筋に針を約5ミリ挿入し、ワクチンを注射します。

針を筋肉に5〜10秒間挿入したままにします。次に、ベベルが下を向くようにシリンジを180度回転させてシールし、ワクチンの漏れを防ぐために、注射部位から針をゆっくりと引っ込めます。次に、完全に回復するまで監視しながらマウスをケージに戻します。

ブースターから約2週間後、免疫されたマウスに感染させます。麻酔をかけたマウスの肩甲骨と首の後ろの背側胸部の首筋をつかみ、マウスを直立させて鼻にアクセスします。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、20〜25マイクロリットルの目的の細菌接種物を動物の各層にゆっくりと塗布し、接種物全体が吸入されるまでマウスを保持します。次に、同量の滅菌PBSをネガティブコントロールとしてマウスの1つのグループに送達します。

適切な実験エンドポイントで、感染したマウスの腹側を上にして解剖ボードに置き、手足を固定します。70%エタノールで体を濡らし、鉗子を使用して骨盤の中央にある腹部の下の皮膚を固定します。鋭利なハサミを使用して、下顎まで垂直に切り込みを入れ、腹壁から皮膚を解剖します。皮膚を死骸の側面に移動して、無菌臓器摘出のための遮るもののないフィールドを作成し、肝臓または肝臓の近くの胸郭の下の無傷の腹膜をつかみます。腹膜を胸郭に向かって切断して下部消化管を露出させ、結腸を左に動かして脾臓を露出させます。

湾曲した鉗子を使用して脾臓をつかみ、はさみで結合組織を解剖します。次に、脾臓を3ミリリットルのRPMIと5%のウシ胎児血清を氷上に含む15ミリリットルの円錐形のチューブに入れます。鉗子を使用して剣状突起で胸郭を安定させ、横隔膜を切り開きます。肺は収縮し、背骨に向かって落ちるはずです。

胸郭の

側面を切り開いて胸当てを取り外し、肺動脈と静脈を切断して右肺の上葉を分離して除去します。葉を10%中性緩衝ホルマリンの15ミリリットルの円錐形チューブに室温で少なくとも24時間固定し、左右の肺の残りの葉を分離します。次に、氷上のPBS中の2ミリリットルの1%カゼインを含む15ミリリットルの円錐形のチューブにローブを置きます。

先端付きの1ミリリットルPIPETMANを使用して胸腔を満たす血液を採取し、氷上の事前に標識された1.5ミリリットルの微量遠心チューブに血液を移します。耳下腺、舌下腺、上顎下腺、および気管を覆うリンパ節を除去し、気管を囲む保護膜を開いて取り除きます。細い鉗子とはさみを使用して、気管を食道から、鎖骨の上部から下顎骨の下部までのその他の結合組織を慎重に分離します。

鉗子を使用して気管を保持し、鎖骨の上部で気管を切断します。気管を引き下げて弾力性を最大化し、喉頭のすぐ上の下顎下部の気管を切断し、約1センチメートルの組織を分離します。次に、氷上のPBS中の0.3ミリリットルの1%カゼインを含む事前に標識された1.5ミリリットルの微量遠心チューブに臓器を入れます。

次に、マウスを回して鼻に確実にアクセスできるようにし、頭に70%エタノールをスプレーします。手動で、頭蓋骨の真後ろで動物をつかみ、はさみを使って鼻の下から上に向かって鼻の柔らかい肉を切り取ります。鼻の周りの毛皮、皮膚、ひげを取り除き、曲線を下に向けて曲線を曲げたハサミの先端を鼻孔に挿入します。

鼻腔を目に向かって切り開き、V字型を作ります。次に、細い鉗子を使用して鼻中隔と地層内の軟部組織を収集し、氷上のPBS中の0.3ミリリットルの1%カゼインを含む事前に標識された1.5ミリリットルの微量遠心チューブに組織を置きます。

肺組織を処理するには、肺サンプルチューブの内容物全体を滅菌の15ミリリットルのダウンスホモジナイザーに移し、乳棒を使用して組織を均質化します。組織の大きな粒子が残らなくなるまでサンプルを解離し、均質化された懸濁液を元の15ミリリットルチューブに戻します。コロニー形成ユニットをプレーティングするために0.3ミリリットルのアリコートを除去し、遠心分離によって残りのホモジネートを収集します。

上

清0.5ミリリットルを事前に標識された微量遠心チューブに分注し、ELISAによるサイトカイン発現分析まで摂氏負20度で保存します。次に、0.1ミリリットルのアイルコートを、希釈あたり0.9ミリリットルの滅菌PBSで、取っておいた均質化された肺懸濁液の0.1ミリリットルを連続希釈し、滅菌トライアングルスプレッダーを使用して、経験的に選択された各希釈液の0.1ミリリットルを、事前に標識された10%Bordet-Gengouとストレプトマイシンプレートにプレートします。