JoVE 実験百科事典
免疫学
0 回視聴 • 3:24 分 • July 8th, 2025
B リンパ球上の B 細胞受容体 (BCR) は抗原に結合し、細胞活性化を引き起こします。これにより、ペプチド断片に処理するための抗原の内在化につながり、ペプチド断片はクラスII MHC分子にロードされ、ヘルパーTリンパ球に提示され、効果的な免疫応答を生成します。
抗原コーティングされたビーズを使用して in vitro で B リンパ球の活性化を研究するには、まず抗原コーティングされたビーズを取得します。これらのビーズは、BCRに特異的な抗原、リガンドで共有結合的にコーティングされています。非反応性タンパク質は、結合していないビーズ部位をブロックし、非特異的なBリンパ球の結合を防ぎます。
ビーズをBリンパ球懸濁液に加えます。混合物をポリ-L-リジンでコーティングされたカバーガラスに播種します。
負に帯電したBリンパ球は、正に帯電したカバーガラスに結合し、細胞を固定します。さらに、ビーズの抗原はBCRに特異的に結合します。BCRと抗原の相互作用はBリンパ球を活性化し、タイトジャンクション、つまり免疫シナプスを形成します。
相互作用は細胞内シグナル伝達経路を開始し、アクチン細胞骨格の再編成をもたらします。これにより、細胞膜が広がり、その後収縮が起こり、その間にBCR抗原マイクロクラスターが免疫シナプス中枢に集中します。
アクチンのリモデリングにより、中心体(微小管の組織化中心)はシナプスの近くに再配置されます。再配置は、リソソームや免疫シナプスの近くにあるゴルジ装置などの細胞小器官を動員して、抗原を抽出して提示します。
抗原コーティングされたビーズは、アミノ基を活性化するために事前にグルタルアルデヒドで処理したアミノビーズと特定のリガンドをインキュベートすることによって調製されます。活性化されたビーズを100マイクロリットルのPBSとボルテックスに再懸濁します。一方、150マイクロリットルのPBSに1mlあたり100マイクログラムのBCRリガンドを加えて抗原溶液を調製します。
次に、抗原溶液に50マイクロリットルの活性化ビーズを加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。また、無関係なリガンドをネガティブコントロールとして使用することを忘れないでください。インキュベーション後、ビーズをPBSで洗浄し、上清を吸引し、PBSと交換します。3回繰り返します。次に、BSAの溶液の500マイクロリットルにビーズを再懸濁することにより、遊離アミノ基をブロックします。最後に、ビーズを70マイクロリットルのPBSに再懸濁します。
最終濃度を計算するには、血球計算盤を使用してビーズを数えることができます。B細胞活性化には、50mlチューブを使用し、5%ウシ胎児血清を添加したCLICKで1mlあたり150万の濃度まで細胞を再懸濁します。次に、100マイクロリットルの細胞ビーズ混合物に対応する150,000個のB細胞をポリ-L-リジンでコーティングされたカバーガラスに加え、異なる時点で37度でインキュベートします。