In vitroでのマウス骨髄細胞の破骨細胞形成に対する抗C-fms抗体の効果

破骨細胞形成は、破骨細胞前駆体が分化して融合して多核破骨細胞を形成するプロセスです。

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骨細胞形成に対する抗c-fms抗体の効果をin vitroで研究するには、マウス骨髄細胞懸濁液を含む培養プレートを取ります。マクロファージコロニー刺激因子、M-CSFを追加します。

培養では、M-CSFは骨髄前駆細胞上の特定の受容体であるc-fmsに結合し、シグナル伝達経路を活性化し、破骨細胞前駆体を表してプレートに付着する骨髄マクロファージ(BMM)への分化を引き起こします。

非

接着細胞を取り除きます。BMMを収穫し、マルチウェルプレートウェルに播種します。M‐CSFと核因子カッパ‐Βリガンドの受容体活性化因子RANKLの補充

抗c-fms抗体濃度の増加をウェルに追加します。

対照井戸では、M-CSF は c-fms 受容体に結合してシグナル伝達経路を活性化し、RANK 受容体の発現を刺激し、BMM の生存と増殖を促進します。RANKL は RANK 受容体に結合し、シグナル伝達カスケードを引き起こし、BMM の分化と破骨細胞への融合を引き起こします。

抗体濃度が高いウェルでは、抗体がc-fms受容体に結合して効果的にブロックし、破骨細胞の分化に必要なシグナル伝達を阻害し、それによって破骨細胞の形成を阻害します。

染色を実行して破骨細胞集団を同定および定量し、RANKL誘発破骨細胞形成における破骨細胞形成を阻害する有効な抗体濃度を決定します。

10センチメートルの培養皿に10ミリリットルあたり1,000万個の細胞を播種し、細胞にM-CSFを加えます。培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%で3日間インキュベートします。3日後に培地を取り出し、10ミリリットルのPBSで細胞を2回激しく洗浄して、非接着細胞を除去します。

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ミリリットルの室温0.02%トリプシン-EDTAをPBSに加え、摂氏37度、5%二酸化炭素で5分間インキュベートします。細胞を完全にピペットで取り除きます。培養物を顕微鏡で観察して、細胞が剥離し、丸みを帯びて培地中に浮遊しているように見えることを確認します。

細胞が剥離したら、5ミリリットルのα-MEMを添加して反応を不活性化します。細胞を50ミリリットルの円錐形チューブに集め、300 x g で5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、5ミリリットルのα-MEMで洗浄し、再び300 x g で5分間遠心分離します。ペレットを10ミリリットルのα-MEMに再懸濁します。

10センチメートルの培養皿に10ミリリットルあたり100万個の細胞を播種し、M-CSFを加えます。培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%で3日間インキュベートします。3日後に破骨細胞前駆体としてBMMを表す付着細胞を採取します。96ウェルプレートで200マイクロリットルのα-MEMあたり50,000細胞でBMMをシードします。

各ウェルに、目的の刺激を追加し、M-CSFを添加して、最終濃度を100ナノグラム/ミリリットルにします。各ウェルに抗c-fms抗体を追加します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で4日間インキュベートし、培地を1日おきに4日間インキュベートし、原稿に記載されているように染色とアッセイを進めます。