成虫のハエにおける宿主とウイルスの相互作用を研究するための胸腔内ウイルスナノ注射

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麻酔をかけた野生型およびDicer-2変異型の雄ショウジョウバエを実体顕微鏡下の注射皿に服用します。ハエにRNAウイルスの複製を抑制する共生細菌がいないことを確認します。

ポジティブセンスの一本鎖RNAウイルス懸濁液を含むナノインジェクターをハエに胸腔内に接種します。

ウイルスは受容体を介したエンドサイトーシスを介して宿主細胞に侵入し、複製して二本鎖中間RNAを産生します。宿主パターン認識受容体Dicer-2は、ウイルスの二本鎖RNAを小さな干渉RNA、siRNAに処理します。

siRNAはRNA誘導サイレンシング複合体であるRISCに結合し、そこで相補鎖が除去されます。RISCを搭載したsiRNAは、相補的な塩基対を介して他のウイルスRNAに結合し、ウイルスRNAの分解と遺伝子サイレンシングを引き起こします。

Dicer-2とウイルスRNAの相互作用は、下流の抗ウイルスシグナル伝達カスケードを活性化し、抗ウイルスタンパク質を産生します。これらの抗ウイルスタンパク質は、隣接する宿主細胞のヤヌスキナーゼ(JAK)タンパク質結合サイトカイン受容体と相互作用し、受容体二量体化とJAKリン酸化を開始します。

活性化されたJAKは、シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子であるSTATタンパク質をリン酸化および活性化します。活性化されたSTATは核に移動し、特定のDNA配列に結合し、抗ウイルス応答遺伝子の転写を開始します。

希望の期間、ハエを育てます。

下流の分析では、Dicer-2変異ハエの生存率の低下とウイルス量の増加が示されています。

ウイルス感染の場合は、まず実体顕微鏡と細い鉗子を使用して、ガラス毛細管針の先端をナノ注入に適した直径に折ります。インジェクターを組み立てるには、シーリングOリングと白いスペーサーを、大きなディンプルを外側に向けてインジェクターの金属プランジャーに置きます。

30ゲージの針を備えた注射器を使用して、ガラス針に鉱物油を満たし、針をカラーに通します。大きなOリングをカラーの付け根の周り、針の鈍い端から約1ミリメートル置き、針をインジェクターのプランジャーに取り付けます。

針をプランジャーに固定し、空のボタンを押して、可聴信号が聞こえるまでマイクロインジェクターのプランジャーを伸ばします。次に、[充填]を押してプランジャーを5ミリメートル引っ込め、針を100プラーク形成ユニットのウイルス懸濁液に浸します。ボルバキアを含まない20個の雄のショウジョウバエの1本または少なくとも3本のバイアルを注射皿にそっと振ってください。

交尾および繁殖中のホルモン変動がメスとの読み出しに影響を与える可能性があるため、オスに恵まれたハエが好まれます。

次に、各ハエの胸部に、中胸膜と四胸膜の間のわずかに明るい色の領域に50.6ナノリットルのウイルス溶液を注入し、先ほど示したように、細胞変性効果アッセイとジハエからの定量的RT-PCRによってDCV負荷を測定します。注射後、ハエを新しいバイアルに慎重に移し、麻酔から回復している間にハエが培地にくっつかないようにバイアルを水平位置に置きます。

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最終更新:29 8月 2026