DSS誘発性大腸炎における結腸損傷を評価するためのヘマトキシリンおよびエオシン染色

デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)は、腸上皮バリアの破壊が炎症を引き起こす炎症性腸疾患である大腸炎を誘発します。

組織の損傷を評価するには、DSS 誘発性大腸炎のマウス モデルから単離された固定結腸組織を採取します。組織を包埋培地に浸漬して切片化を容易にし、急速に凍結します。

クライオミクロトームを使用して、薄い組織切片を取得し、スライドガラスに収集します。

媒染剤(金属カチオン)に結合した酸化ヘマトキシリン色素を含む溶液にスライドを浸し、色素に正電荷を与えます。色素媒染剤複合体は負に帯電したDNAに結合し、核を赤紫色に染色します。

組織を分化酸アルコール溶液に沈め、細胞質および細胞外マトリックスから非特異的に結合した色素を除去します。アルカリ性媒体であるブルーイング剤で組織をすすぎ、核に青色を与え、コントラストを高めます。

スライドをアルコール濃度を上げて組織を脱水し、対抗染色の浸透を高めます。

組織を対比染色(酸性エオシン溶液)に浸し、塩基性細胞質タンパク質と細胞外マトリックスにピンク色を与えます。スライドをアルコールで洗浄して、余分なエオシンを取り除きます。組織をキシレンに浸して組織を透明にし、顕微鏡検査を改善します。

顕微鏡下では、結腸切片に組織損傷の悪化が見られ、DSS 誘発性大腸炎が示されています。

単離された結腸組織のヘマトキシリンおよびエオシン染色のために、翌朝、サンプルの凍結保護のために、個々の15ミリリットルチューブでPBS中の30%スクロースに組織片を一晩浸します。翌日、組織を最適な切断温度またはOCTコンパウンドに埋め込み、OCTが硬化するまで組織を摂氏マイナス20度で冷却します。

OCTブロックをクライオスタットに入れ、厚さダイヤルを12マイクロメートルに設定し、厚さ12マイクロメートルの凍結切片をスライスしてガラス顕微鏡スライドに収集します。すべての組織が切片化されたら、スライドをホットプレート上で摂氏65度で20分間温め、加熱した切片を蒸留水で短時間洗浄してから、ヘマトキシリン染色液で5分間染色します。

流水水道水中の余分なヘマトキシリン溶液を5分間除去し、エタノール中の0.5%塩酸で30秒間切片を区別し、続いて流水道水で1分間すすぎます。次に、サンプルをPBSで1分間洗浄し、続いて流水水でさらに5分間洗浄します。

洗浄の最後に、組織を上昇エタノールシリーズに10秒間浸漬し、続いてエオシンで2分間対比染色します。サンプルの脱水には、スライドを95%エタノールと100%エタノールを2回交換して1回に5分間浸漬し、続いてキシレンで5分間2回交換してクリアします。次に、各実験グループの近位結腸、中結腸、遠位結腸への組織損傷をスコアリングします。