宿主と微生物叢の相互作用を研究するためのex vivo腸管臓器培養システム

宿主と腸内細菌叢の間の相互作用を ex vivo で研究するには、特定の腸内コロニー形成細菌を含まないマウス結腸組織から始めます。組織を培地で洗い流して糞便を取り除き、適切な培地を含むマルチウェルプレートに移します。

同時に、マルチウェルのex vivo腸臓器培養装置を組み立てます。

デバイスの各ウェルは、2つのペアの入力ポートと出力ポートで構成されており、1つ目は結腸内腔に接続し、2つ目は組織の生存率を維持するためにウェルに培地を継続的に供給します。

組織をデバイスに移します。結腸の近位端と遠位端を最初の入力ポートと出力ポートのペアに接続します。結腸内腔への管腔刺激剤の流れを開始し、ウェルへの中程度の流れを開始します。

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覚醒剤には、粘液層分解酵素を分泌する腸内コロニー形成細菌が含まれており、下にある上皮細胞に付着します。これにより、常在樹状細胞が上皮細胞間の樹状突起を伸ばし、細菌抗原を捕捉し、特定の免疫応答を生成するシグナル伝達カスケードが活性化されます。

その結果、ナイーブCD4+ T細胞はTh17細胞に分化します。

Th17 細胞は、他の免疫細胞を活性化して侵入する病原体と闘い、腸バリアの完全性を維持する炎症誘発性サイトカインを産生します。

まず、鈍い端の針をデバイス型内の適切な位置に挿入し、デバイスと蓋の1セットに約20gのポリジメチルシロキサンまたはPDMS混合物をキャストします。金型を真空チャンバーに30分間入れてPDMSミックスから気泡を取り除き、金型を摂氏55度で一晩インキュベートしてPDMS重合を完了します。

PDMSがセットされたら、型から針を引き出し、培養装置と蓋を慎重にプラスチック型から外します。外科用ブレードを使用して、ウェルの輪郭からPDMS残留物を取り除きます。

無毒のシリコーン接着剤を使用して、デバイスカバー内のPDMSデバイスを75 x 50ミリメートルのマイクロスライドのカバーガラスに取り付け、部品を一晩固定させます。デバイスの滑らかな面に接着剤を塗布します。内腔には 12 本の 22 ゲージ針を、ウェルには 12 本の 18 ゲージ針を挿入します。シリコンを使用してすべての針を所定の位置に固定し、一晩固めます。

入力シリンジをパージし、ウェル培地がすべてのチューブから廃ガラスに流れ出していることを確認します。次に、入力シリンジをパージし、刺激がすべてのチューブから廃ガラスに流れ出るようにし、さまざまな刺激を汚染しないように注意します。

ネズミを犠牲にした後、鋭利なハサミと鉗子を使って解剖し、脂肪と結合組織をすべて切って胃から肛門にかけて消化管を取り出します。結腸を切り、新しいプレートに置きます。ティッシュを端だけ優しく保持しながら、接触を最小限に抑えます。解剖顕微鏡下で結腸フラッシュを行います。

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