細胞内染色およびフローサイトメトリーによるサイトカイン産生に対するタバコ製品調製物の影響の解析

炎症刺激物との相互作用により、免疫細胞は炎症シグナル伝達分子(サイトカイン)を放出し、免疫応答を引き起こします。

たばこ製品製剤であるTPPの効果を分析するには、TPP濃度を増加させたマルチウェルプレートを取ります。ヒト末梢血単核球、免疫細胞を含むPBMCをプレートに播種します。

TPPの免疫抑制剤であるニコチンは、ニコチン性アセチルコリン受容体に結合し、炎症誘発性サイトカイン産生をダウンレギュレートします。このダウンレギュレーションは用量依存的であり、濃度が高いほど効果が高くなります。

遠心分離して細胞をペレット化し、TPP残基を含む上清を廃棄します。

細胞を完全な培地に再懸濁し、免疫刺激剤であるリポ多糖類とタンパク質輸送阻害剤であるGolgiPlugを含む混合物を加えます。

リポ多糖類分子は、トール様受容体-4を含む免疫細胞と相互作用し、細胞内シグナル伝達経路と炎症誘発性サイトカインの産生を引き起こします。一方、ゴルジプラグ分子はゴルジ体からのサイトカイン分泌をブロックし、その蓄積を可能にします。

細胞を固定液で固定し、細孔形成剤で透過性化します。蛍光色素タグ付き抗サイトカイン抗体のカクテルを細胞に重ね、細孔から入り、それぞれの細胞内サイトカインに結合します。

蛍光シグナルを測定するフローサイトメトリーで染色細胞を分析します。

サイトカイン産生のレベルを決定します。用量依存的な減少は、TPPの免疫抑制効果を示します。

染色手順を開始する前に、スモークコンディショニング培地全体とニコチンをRPMI完全培地でリストされた濃度で希釈し、96ウェルプレートでウェルあたり100マイクロリットルの総容量に希釈します。次に、ウェルあたり10倍の濃度で100マイクロリットルのPBMCを完全培地に懸濁して、ウェルあたり6番目の細胞に添加し、ウェルあたり200マイクロリットルの総容量にします。次に、プレートに蓋をし、摂氏37度、CO₂ 5%でインキュベートします。

3時間後、細胞を洗浄し、上清を吸引します。次に、プレートを再び覆い、ボルテックスしてペレットを解離させます。細胞をさらに2回洗浄し、1回は氷冷のランニングバッファーで、もう1回は完全培地で洗浄します。

2回目の洗浄後、ウェルあたり200マイクロリットルの完全培地で処理し、GolgiPlugとLPSを摂氏37度および5%CO₂で6時間補充します。次に、細胞を氷冷のランニングバッファーで洗浄し、摂氏4度でウェルあたり100マイクロリットルのCytofixで処理します。20分後、氷冷パームウォッシュで細胞を3回洗浄します。

次に、45マイクロリットルのCytopermを各ウェルに加え、続いて5マイクロリットルのリストされた抗体をそれぞれ添加します。摂氏4度で30分後、細胞を3回洗浄し、200マイクロリットルの氷冷2%パ