黄色ブドウ球菌によるin vitroバイオフィルム合成

細菌バイオフィルムは、宿主の免疫応答を回避する、自己生成された細胞外マトリックスに埋め込まれた細菌群集からなる三次元構造です。

in vitro黄色ブドウ球菌バイオフィルム調製では、所望の細胞密度の活発に増殖する黄色ブドウ球菌懸濁液をマルチウェルプレートのポリ-L-リジンでコーティングされたウェルに移します。

静的条件下でのインキュベーション中、正に帯電したポリ-L-リジンコーティングは、細菌表面のテイコ酸などの負に帯電した糖質ポリマーとの静電相互作用を促進し、細菌の付着を促進します。

利用可能な栄養源により、黄色ブドウ球菌は分裂して蓄積し、マイクロコロニーを形成します。さらに、細菌は多糖類、タンパク質、細胞外 DNA からなる細胞外マトリックスを分泌し、細胞を包み込み、細菌の凝集と表面接着を促進します。

細胞分裂とマトリックス分泌が続くと、バイオフィルムは細胞間コミュニケーションのための効率的なシグナル伝達分子分布を持つ三次元構造に成熟します。

閾値の細菌密度に達すると、黄色ブドウ球菌はプロテアーゼとヌクレアーゼを分泌し、バイオフィルムマトリックスを分解し、少数の黄色ブドウ球菌を培地に放出します。浮遊性浮遊性浮遊細菌を含む培地を取り除きます。

バイオフィルムの破壊を防ぐために、バッファーをそっと加えます。残っている未付着菌を含むバッファーを取り除きます。

生成されたバイオフィルムは、下流の実験の準備が整います。

プシン大豆寒天培地などの栄養豊富な寒天プレート上でストリークプレート技術を使用して、凍結保存されたストックから黄色ブドウ球菌の単離コロニーを取得することから始めます。96ウェルプレートの個々のウェルを滅菌水で希釈した100マイクロリットルのPLLでコーティングし、室温で30分間インキュベートします。真空支援吸引トラップを使用して、PLL溶液を無菌的に吸引します。井戸を室温で一晩乾燥させます。

2%グルコースを添加したMEM-αに黄色ブドウ球菌のコロニーを接種して一晩培養し、摂氏37度で毎分200回転で16〜18時間インキュベートします。50マイクロリットルを2%グルコースを添加した5ミリリットルの新鮮なMEM-αに移すことにより、一晩培養物を希釈します。次に、摂氏37度で毎分200回転で、対数中期に達するまでインキュベートします。MEM-alphaを使用して、対数中培養をOD0.1に正規化します。

150マイクロリットルの正規化培養物をPLL処理した96ウェルプレートの各ウェルに移します。プレートを摂氏37度の加湿チャンバーで18〜20時間インキュベートします。上清を吸引して浮遊細胞を除去します。残りのバイオマスを150マイクロリットルのHBSSで穏やかに洗浄し、付着していない細胞を除去します。少なくとも2回繰り返して、すべてのプランクトン細胞を取り除きます。