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病原性細菌であるインフルエンザ菌を介してリンパ球を刺激するには、リンパ球や抗原提示細胞またはAPCを含む、単離された末梢血単核球(PBMC)の懸濁液を採取します。
細菌懸濁液を加え、生理学的温度でインキュベートします。
APC上のパターン認識受容体は、細菌細胞の特定の成分に結合し、食作用を引き起こします。内在化された細菌を含むファゴソームはリソソームと融合し、細菌の分解を引き起こし、ペプチド断片に加工します。
主要な組織適合性複合体またはMHC分子は、ペプチドフラグメントに結合し、抗原として細胞表面に提示します。Tリンパ球は、T細胞受容体を介して提示された抗原に結合します。
Tリンパ球上の特定の表面受容体に結合する共刺激抗体を追加します。相乗的な結合は下流のシグナル伝達を誘導し、Tリンパ球サイトカイン産生を活性化します。
小胞体からゴルジ体への小胞タンパク質輸送を遮断するゴルジ遮断化合物を添加して、T リンパ球からのサイトカイン分泌を阻害し、細胞内サイトカインの蓄積を促進します。
細胞形態を維持するための固定剤と、細胞膜を透過性化するための界面活性剤を追加します。Tリンパ球特異的表面マーカーに結合する抗体(細胞表面を標識する)や、細胞内に浸透して細胞内サイトカインに結合するサイトカイン特異的抗体など、蛍光標識抗体のカクテルを追加します。
フローサイトメトリーを実行して、刺激されたTリンパ球によるサイトカイン産生を示す二重蛍光を持つ細胞を検出します。
末梢血サンプルをアリコートに分けて、コントロールと抗原刺激を行います。両方のサンプルに共刺激抗体を加え、次に型付け不可能なインフルエンザ菌を抗原サンプルに加え、摂氏37度、二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。
次に、ゴルジ遮断剤ブレフェルジンAをサンプルに加え、さらに5時間インキュベートします。前に示したように赤血球を溶解した後、500マイクロリットルの1%〜2%パラホルムアルデヒドを使用して白血球を1時間固定します。血球計算盤を使用して細胞をカウントし、100万個の細胞を100マイクロリットルの0.1%サポニンで15分間透過処理します。
次に、細胞を適切な蛍光標識抗体とともにインキュベートします。細胞を洗浄し、フローサイトメーターを使用して分析します。関連するリンパ球集団をゲーティングすることにより、抗原応答細胞の割合を決定します。分析するすべてのサイトカインについて、刺激されていない細胞でバックグラウンド染色を実行します。