感染したヒト組織由来細胞における炎症性メディエーターの定量化

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感染中、活性化されたリンパ球は炎症性メディエーター(サイトカイン)を放出し、免疫応答を誘発します。

感染した組織の炎症性メディエーターを定量するには、ヒト肺組織由来の免疫細胞を含む細胞懸濁液から始めます。

細胞を呼吸器病原性細菌であるインフルエンザ菌とインキュベートします。細菌の表面抗原は、食作用免疫細胞のパターン認識受容体と相互作用します。これにより、細菌の内在化、より小さなペプチドへのプロセシング、および主要な組織適合性複合体分子によるペプチドの提示が開始されます。

食細胞上の抗原MHC-II分子は、共刺激受容体相互作用とともにT細胞受容体を介してTリンパ球に結合し、Tリンパ球の活性化と炎症誘発性サイトカインの産生をもたらします。

細胞をゴルジ遮断薬で処理し、サイトカイン放出を損ない、細胞内に細胞内に蓄積させます。細胞をブロッキングバッファーで洗浄し、非特異的結合部位をブロックします。

ヒトTリンパ球表面マーカーに特異的に結合する蛍光色素標識抗体の混合物で細胞懸濁液を染色し、リンパ球の標識を可能にします。

細胞を固定し、細孔形成界面活性剤で透過性化します。透過処理された細胞を蛍光色素標識抗サイトカイン抗体とインキュベートし、細胞に入り、特定のサイトカインと相互作用します。

フローサイトメトリーを使用して、標識リンパ球内のサイトカイン蛍光シグナルを測定し、細菌感染による炎症性メディエーター産生と相関させます。

20〜40グラムの肺葉切除サンプルを3〜5立方ミリメートルのセクションにスライスします。それらを無菌の50マイクロリットルチャンバー内に置き、適切なディスアグリゲーターを使用して組織を機械的に断片化します。組織の分解後、示されているように赤血球を溶解し、細胞を滅菌RPMIに再懸濁します。次に、100マイクロメートルの滅菌ナイロンメッシュで細胞をろ過し、トリパンブルー除外法を使用して生細胞の数をカウントします。

感染アッセイでは、肺細胞をRPMIでチューブあたりミリリットルあたり400万細胞の最終濃度に再懸濁します。次に、細胞あたり100個の細菌のMOIで細胞に感染させます。キャップを半回転ほど緩めて、チューブ内のガス移動を可能にします。細胞をチューブローテーターに入れ、12RPMで回転させながら摂氏37度でインキュベートします。刺激の1時間後、サイトカインの細胞外輸出を防ぐためにブレフェルジンAを加え、細胞懸濁液をローテーションでさらに16〜22時間インキュベートします。

翌日、1%ウシ血清アルブミンと0.01%アジ化ナトリウムを含む500マイクロリットルのPBSで細胞懸濁液を洗浄します。次に、特定のヒトリンパ球細胞表面マーカーの細胞懸濁液に1時間留まります。次に、細胞をPBSで洗浄し、前に示したように固定して透過処理します。次に、細胞を細胞内サイトカイン染色抗体と1時間インキュベートします。次に、細胞を洗浄し、100マイクロリットルのPBSに再懸濁してから、フローサイトメーターでデータを取得します。

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Last updated: 18 July 2026