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オプソニンでタグ付けされた細菌は、特定の好中球受容体によって認識され、活性酸素種(ROS)による食作用、放出、および細菌の分解
を引き起こします。 invitroで好中球によるROS産生を定量化するには、マルチウェルプレートを取ります。テストウェルには、細胞外マトリックスフィルムに埋め込まれた細菌を含む黄色ブドウ球菌バイオフィルムが含まれています。コントロールウェルはバイオフィルムがありません。
バイオフィルムをヒト血清とインキュベートし、血清オプソニンがバイオフィルムをオプソニン化できるようにします。
血清を吸引します。バッファーで洗浄し、結合していないオプソニンを除去します。好中球とルミノール(化学発光化合物)をウェルに加えます。好中球をバイオフィルムに近づける遠心分離機。
プレートリーダーを使用して、経時的な発光を測定します。
バイオフィルムを含む井戸では、好中球がバイオフィルムのオプソニンに結合し、好中球の活性化とファゴソームへの細菌の内在化を引き起こします。特定のシグナル伝達経路が活性化され、ファゴソーム上でNADPHオキシダーゼの集合が引き起こされます。
NADPHオキシダーゼは、NADPHから酸素分子への電子移動を触媒し、細菌を分解するROSを生成します。さらに、細胞膜上のNADPHオキシダーゼはROSを細胞外に放出します。
これに応じて、バイオフィルム細菌はROSを中和する酵素を産生し、好中球膜に細孔を形成して溶解を引き起こすロイコシジンを放出し、ROSの産生を妨害します。ルミノールはROSと反応してその励起を引き起こし、緩和すると発光を放出します。
テスト井戸は、対照と比較してROSレベルの増加を示し、好中球とオプソニン化バイオフィルムの相互作用を示しています。
HBSSで希釈した100マイクロリットルの20%正常ヒト血清を洗浄したバイオフィルムに滴下し、摂氏37度で30分間インキュベートしてバイオフィルムをオプソニン化します。血清溶液を吸引し、バイオフィルムを150マイクロリットルのHBSSで滴下洗浄します。HBSSを吸引し、オプソニン化されたバイオフィルムを含むウェルを残します。
HBSSに再懸濁した好中球にルミノールを加えて、最終濃度5マイクロモルのルミノールを構成する。この溶液は、グループAおよびCにすぐに使用できます。ルミノールと混合した好中球をオプソニンバイオフィルムのあるウェルに加えます。
グループDの場合、好中球を含まない別のチューブでHBSS中の50マイクロモルルミノール溶液を調製し、バイオフィルムを含むウェルに加えます。ルミノールと混合した350マイクロリットルの好中球を分注し、1ミリリットルあたり500ナノグラムの最終濃度でPMAを混合物に加えます。
グループBの場合、この混合物からの好中球をバイオフィルムのないウェルに加えます。これはポジティブコントロールとして機能します。プレートを摂氏4度で270 RCFで30秒間遠心分離します。プレートリーダーが摂氏37度に設定され、発光とキネティックリードが3分間隔で60分間
行われていることを確認します。プレートをプレートリーダーに入れて、好中球によるROS産生を60分間測定します。