タバコ製品調製物に曝露された末梢血単核細胞によるK562細胞の死滅

腫瘍細胞はエフェクター免疫細胞を活性化して、サイトカインとパーフォリンとグランザイムを含む細胞溶解性顆粒を放出します。パーフォリンは腫瘍細胞膜に細孔を形成し、グランザイムの細胞への侵入を促進し、アポトーシスを開始し、細胞死を引き起こします。

ヒト末梢血単核球 (PBMC) の細胞溶解機能を分析するには、たばこ製品の調製、TPP、曝露に続いて、TPP 濃度が増加したマルチウェル プレートを取ります。培地を含む井戸が対照として機能します。

PBMC懸濁液を追加します。TPP の主要な免疫抑制剤であるニコチンは、エフェクター PBMC のニコチン性アセチルコリン受容体に結合し、炎症誘発性サイトカイン産生をダウンレギュレートします。

遠心機。TPP含有上清を除去します。PBMCを培地に再懸濁します。蛍光標識K562細胞、PBMCエフェクター細胞の細胞毒性に対する感受性が高いヒト白血病細胞をウェルに加えます。

免疫応答が抑制されたTPP処理エフェクター細胞は、パーフォリン発現とサイトカイン放出の低下を示し、PBMCの細胞溶解能力を低下させます。

遠心機。細胞を緩衝液に再浮遊させ、続いて細胞不透過性蛍光色素で再懸濁します。色素は膜が損傷した細胞に入り、DNAを染色します。

フローサイトメーターを使用して、ウェル内の死細胞と生K562細胞の割合を測定します。TPP濃度が高いウェル内の死んだK562細胞の割合が対照よりも低いことは、TPP処理PBMCによるK562細胞の死滅の抑制を示しています。

先ほど示したように、たばこ製品で処理されたPBMCのプレートを調製した後、10ミリリットルのDPBSで80%コンフルエントで回収したK562細胞の培養物を洗浄します。ペレットを5ミリリットルのDPBSに再懸濁し、細胞をカウントします。次に、1ミリリットルの完全培地中の7番目のK562細胞に1〜2倍の10倍の1〜2ミリリットルの新たに調製したCFSE作業溶液を加え、ボルテックスによって細胞染色を分散させます。

細胞を室温でインキュベートします。ちょうど2分後、200マイクロリットルのFBSを加え、細胞を再びボルテックスし、さらに2分間インキュベートします。

2回目のインキュベーション後、細胞を10ミリリットルの完全培地で洗浄します。次に、ペレットをさらに10ミリリットルの完全培地に再懸濁し、細胞をカウントします。次に、タバコ処理されたPBMCを遠心分離し、上清をデカントします。次に、カバーを元に戻し、ボルテックスによって細胞を再懸濁し、ウェルあたり200マイクロリットルの完全培地で洗浄します。

キリングアッセイを開始するには、CFSE標識K562細胞をPBMCに1〜15の比率で添加し、共培養を摂氏37度および5%CO2でインキュベートします。

5時間後、細胞をスピンダウンし、上清を廃棄します。ボルテックスによってペレットを再懸濁し、ウェルあたり200マイクロリットルのランニングバッファーで細胞を洗浄します。次に、95マイクロリットルのランニングバッファーを加え、続いて5マイクロリットルの7-AADを加え、ウェルあたり100マイクロリットルの総量にします。

最後に、細胞を室温で暗所で15分間インキュベートし、次に、各ウェルに100マイクロリットルのランニングバッファーを加え、全容量を適切な対応するFACSチューブに移して、フローサイトメトリー分析によって7-AADおよびCFSE陽性細胞の割合を決定します。