細菌凝集体に対する抗菌処理を研究するためのIn Vitro技術

細菌凝集体に対する抗菌剤の影響を研究するには、凝集体形成を促進する増殖培地で緑膿菌培養を行い、感染中の成長をシミュレートします。

操作された細菌は、蛍光顕微鏡下で凝集体を検出するための蛍光タンパク質を発現します。3次元で画像化して、凝集体の体積、つまり細菌のバイオマスを計算し、経時的なバイオマスの増加を視覚化し、細菌の増殖を示します。

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リスチン(カチオン性抗菌ペプチド)を亜致死濃度で添加し、抗生物質耐性のある細菌を選択しながら感受性細菌を殺します。

コリスチンは、細菌の外膜上の負に帯電したリポ多糖類(LPS)に結合し、LPS単層を安定化するカチオン性架橋を置き換え、膜の完全性を損ないます。

コリスチンはペリプラズムに入り、細胞膜上のLPSに結合し、膜を破壊して細胞溶解を引き起こします。対抗メカニズムとして、細菌のサブセットにおける特定の遺伝子変異がLPSの負電荷を中和します。この修飾は、陰イオン性LPSの少ないカチオン性コリスチンの静電相互作用を阻害し、細胞死を防ぎます。

時間の経過に伴うバイオマスの減少を視覚化し、抗菌剤の影響を示す画像。ヨウ化プロピジウムまたはPI(蛍光色素)を加え、損傷した膜から侵入してDNAに結合し、死んだ細胞のみを標識します。

蛍光活性化細胞選別(FACS)を実行し、PI標識感受性細胞と蛍光標識抗生物質耐性細胞を分離します。細胞は下流のアッセイの準備ができています。

共焦点レーザー走査顕微鏡で緑膿菌凝集体を画像化するには、インキュベーションの最後に、培養プレートの3つのウェルを抗生物質治療として1つのウェルに「無処理コントロール」として指定し、プレートを顕微鏡の加熱ステージに置きます。

63倍の油浸対物レンズを選択し、検索タブを開いて、明るい視野の細菌凝集体を特定します。各ウェル内のイメージングの領域を定義し、位置モジュールを使用して領域の位置を格納します。励起波長を488ナノメートル、発光波長を509ナノメートルに設定します。

取得モジュールで、Zスタックオプションを選択して画像を取得し、ライン平均化モジュールを使用して、Zスタック画像の総体積内でGFPチャネルのバックグラウンド蛍光を低減します。時系列オプションを設定して、各ウェルで15分間隔で18時間60スライスをキャプチャし、明確なフォーカス戦略を使用して、実験中の各時点で再画像化される各位置の焦点面を保存します。

イメージング実験を設定してから 4.5 時間後、抗生物質を追加する前に、各位置を画像化して、4 つのウェルのそれぞれ内の総バイオマスを決定します。6時間後、各ウェルの中央、気液界面のすぐ下に、最小阻害濃度を2倍下回る抗生物質をそっと追加し、[実験の開始]をクリックして抗生物質治療後のイメージングを開始します。

生細胞を単離するには、18時間のイメージング期間の終わりに、メーカーの推奨に従って、各ウェル内の細菌を適切な量のヨウ化プロピジウムで標識します。インキュベーションの最後に、断熱容器を使用してプレートをフローサイトメーターに移し、70ミクロンのノズルを使用してGFPとヨウ化プロピジウムを検出するようにサイトメーターを設定します。次に、各培養上清の1ミリリットルのアリコートを最低流速で流して、生存可能なGFP陽性および非生存可能なヨウ化プロピジウム陰性緑膿菌凝集体を選別します。