In vitroでの細胞内および新興細胞外リステリア菌のフローサイトメトリー解析

マクロファージ培養物を含むマルチウェルプレートを取ります。蛍光タンパク質発現リステリア菌(Listeria monocytogenes,Lm)に感染する。

Lm上のタンパク質は特定のマクロファージ受容体に結合し、ファゴソーム内の細菌を内在化します。さらに、Lm はファゴソーム膜を破壊する細孔形成毒素を分泌し、細菌をサイトゾルに放出し、そこで細菌が複製して宿主アクチンフィラメントに囲まれます。

Lm上のアクチン集合誘導ActAタンパク質は、細菌の後端で連続アクチン重合を誘導します。生成されたアクチン彗星の尾部は、細胞質ゾルを通してLmを推進し、マクロファージ細胞膜を貫通し、重合したアクチンエンベロープLmを培地に放出します。

インキュベーション後、一連のウェルから細胞外アクチン結合Lm含有培地を収集して固定します。パラホルムアルデヒドを使用してLmを修正します。蒸留水を加え、マクロファージを破壊し、細胞内Lmを放出します。細胞内Lmを収集し、パラホルムアルデヒドを使用してサンプルを固定します。

他のウェルでは、培地を細胞不透過性ゲンタマイシン含有培地に置き換えて、細胞外Lmを除去します。新鮮な培地と交換し、希望の期間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞外Lm含有培地を収集し、サンプルをパラホルムアルデヒドで固定します。蒸留水を使用して細胞内Lmを含むライセートを取得し、サンプルをパラホルムアルデヒドで固定します。蛍光標識ファロイジンをサンプルに加え、重合アクチンに選択的に結合します。

フローサイトメーターを使用して、サンプル中のLmおよびアクチン結合ファロイジンからの蛍光シグナルを視覚化します。感染したマクロファージに由来する細胞外および細胞内のアクチン結合Lmを定量化します。

自動セルカウンターを使用して、調製したRAW264.7細胞を1ミリリットルあたり1 x 10⁶細胞の濃度に調整します。1ミリリットルのサンプルを6ウェル組織培養プレートのウェルに加えます。50の感染の多重度に対応する準備されたLm接種物で細胞に感染させます。

感染後1.5時間で、500マイクロリットルの4%PFAで満たされた1.5ミリメートルの微量遠心チューブで、最初のウェルセットから培地を収集し、チューブを氷の上に置きます。細胞内Lmを収集するには、各ウェルに1ミリリットルの蒸留滅菌水を加えます。60秒後、得られた水溶解物を500マイクロリットルの4%PFAを含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。チューブを10秒間激しく渦に巻き込み、氷の上に置きます。

残りのウェルについては、培地を取り除き、1ミリリットルのDMEM / FCSと5ミリリットルのゲンタマイシン5マイクログラムに置き換えて、細胞外Lmを殺します。すぐに皿をインキュベーターに戻します。

30分後、培地を取り出し、ゲンタマイシンを含まないDMEM/FCSに交換します。さらに2〜4時間後、2番目と3番目の時点でライセートの培地をチューブに集め、氷の上に置いて冷やします。チューブを10,000倍gで7分間遠心分離します。

ピペットを使用して、ペレットを乱すことなく上清を除去します。50マイクロリットルの4%PFAと15マイクロリットルのファロイジンを含む染色カクテルをチューブに加え、混合して各ペレットを再懸濁します。チューブを摂氏4度の暗所で20分間インキュベートします。

インキュベーション後、各チューブに1ミリリットルのFACSバッファーを加え、ピペットを上下に移動して混合します。遠心分離機内でチューブを10,000回gで7分間回転させます。ペレットを乱すことなく上清を除去します。

すぐに使用するには、各ペレットを400マイクロリットルのFACSバッファーに懸濁します。後で分析するために保管する場合は、200マイクロリットルのFACSバッファーと200マイクロリットルの4%PFAをチューブに加え、混合して懸濁させます。