培養昆虫細胞におけるショウジョウバエC型ウイルスのウイルス感染量を決定するためのアッセイ

ショウジョウバエCウイルス(DCV)は、陽性の一本鎖RNAウイルスであり、一般的にショウジョウバエに感染します。

感染中、DCV は宿主細胞機構を使用してウイルスゲノムを複製し、最終的にウイルス粒子を生成します。感染した細胞は細胞変性効果であるCPEを示し、分裂できないために溶解を受けるか、溶解せずに死滅します。

ウイルス組織培養の平均感染量を決定するために、感染細胞の半分がCPEを示すDCV濃度は、連続希釈したDCV懸濁液から始めます。

天然のDCV宿主であるショウジョウバエの後期胚に由来する半接着性ショウジョウバエS2*細胞を含むマルチウェルプレートに移します。培地と細胞を含むウェルは、ネガティブコントロールとして機能します。

ウイルスが細胞に感染するまでインキュベートします。ウイルスに感染した細胞は、細胞の損傷と死によってCPEを示します。インキュベーション後、顕微鏡下でウェルを観察します。

希釈液全体でCPEポジティブウェルとネガティブウェルを特定します。適切な方法を使用して、DCVのウイルス組織培養感染平均線量を決定します。

ウイルス組織培養の平均感染量を決定するには、まず、100マイクロリットルの完全培地に1 x 10⁵ S2スターセルを96ウェルプレートの12列のカラムあたり8ウェルに播種します。次に、プレートを摂氏25度のインキュベーターに戻します。

摂

氏マイナス80度の保管場所からウイルスのチューブを5本ランダムに選択します。細胞が沈降している間に、10本の滅菌1.5ミリリットル微量遠心チューブに450マイクロリットルの無菌完全培地を充填し、450マイクロリットルの滅菌完全培地を含む最初の1.5ミリリットルチューブに50マイクロリットルのウイルスストックを加え、懸濁液をステップごとに10倍に希釈して12番目のウェルにします。

インキュベーションの最後に、各希釈液50マイクロリットルをそのウイルスのチューブの各カラムの適切なウェルに加え、ネガティブコントロールウェルとして、ウイルスを含まない50マイクロリットルの培地をカラムごとに1つのウェルに加えます。次に、プレートを摂氏25度のインキュベーターに3日間置き、明視野顕微鏡下で毎日20倍の倍率で各ウイルスストックの細胞変性効果を評価します。

細胞がぼやけて見え、培地が断片でいっぱいのウェルを陽性ウェルとして、細胞形態が正常なウェルをネガティブウェルとして分類します。