蛍光顕微鏡法によるインフラマソーム活性化の検出

NOD様受容体P3、またはNLRP3のインフラマソーム活性化を検出するには、NLRP3タンパク質を発現する活性化マクロファージを含むマルチウェルプレートを取ります。

細胞をイオノフォアとグリシンを含む培地で処理します。イオノフォアはカリウムイオンの流出を誘導し、NLRP3タンパク質を活性化およびオリゴマー化します。オリゴマー化されたNLRP3はアダプタータンパク質を動員し、プロカスパーゼ-1の結合を促進し、NLRP3インフラマソーム複合体を形成します。

インフラマソームでは、近接するとプロカスパーゼ-1の自己切断が引き起こされ、活性カスパーゼが放出され、パイロトーシスと核凝縮が開始されます。さらに、グリシンは細胞構造を安定させ、細胞溶解を防ぎます。

カスパーゼ-1結合基とアミノ酸配列を介して結合した蛍光色素を含む蛍光レポータープローブでマクロファージを処理します。活性化されたカスパーゼ-1は、プローブのアミノ酸配列を認識し、そのカスパーゼ結合基に結合し、その視覚化を可能にします。

細胞を固定し、蛍光色素で重ねて核を染色します。蛍光顕微鏡下での画像。

色の凝縮核と活性化カスパーゼ-1の緑色の蛍光病巣を持つマクロファージをカウントし、NLRP3インフラマソームの活性化を示唆します。

まず、ガラスカバーガラスに播種されたLPSプライミング骨髄由来マクロファージの培地を、ウェルあたり5マイクロモルのニゲリシンと5ミリモルのグリシンを添加した290マイクロリットルのDMEM-5培地に置き換えます。24ウェルプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で60分間細胞培養インキュベーターに戻し、最初の15分後に10マイクロリットルの30X FAM-YVAD-FMKを加えます。

インキュベーションの最後に、ウェルあたり1ミリリットルの冷たいPBSで細胞を洗浄ごとに5分間3回洗浄し、ウェルあたり250マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドで細胞を氷上で30分間固定し、光から保護し、最後の5分間に適切な蛍光核色素で細胞を標識します。

インキュベーションの最後に、先ほど示したように、細胞を冷たいPBSで3回洗浄し、各スライドに7マイクロリットルの色あせ防止封入剤をロードします。各スライドにカバーガラスを置き、カバーガラスをマニキュアで密封する前に、封入剤を一晩固めます。

蛍光共焦点顕微鏡で細胞を画像化するには、未処理のコントロールスライドを顕微鏡ステージに置き、手動で細胞に焦点を合わせます。顕微鏡のルックアップテーブル設定を使用して、未処理の細胞で陽性のプローブの立位が観察されなくなるまでオフセットを調整します。

次に、ニゲリシン処理されたサンプルを使用して、プローブ染色に対して陽性と陰性の両方の細胞を含むフィールドを見つけ、プローブチャネルのイメージング面を陽性染色の強度が最も高い平面に調整します。次に、凝縮した核を持つ細胞に病巣が見えるまでゲインを調整し、スライドごとにランダムに選択された5つのフィールドの画像を合計100倍の倍率で取得します。