ニゲリシン曝露後のマクロファージ死を検出するための乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ

リポ多糖類でプライミングされたマクロファージを含むアッセイプレートを取ります。

プライミングは、不活性な炎症誘発性サイトカイン前駆体とNLRP3タンパク質の発現を増加させます。

カリ

ウムイオノフォアであるニゲリシンを添加し、イオン流出を促進します。これにより、細胞内のカリウムレベルが破壊され、NLRP3タンパク質が引き起こされ、大きな複合体が形成されます。

オリゴマー化したNLRP3は、アダプタータンパク質ASCを動員し、それらの重合を引き起こします。ASCフィラメントはプロカスパーゼ-1を動員し、マルチタンパク質複合体であるNLRP3インフラマソームを形成します。

プロカスパーゼ-1は近接誘発性自動活性化を受け、カスパーゼ-1を生成します。カスパーゼ-1は、炎症誘発性サイトカインとガスデルミン-Dタンパク質を切断し、原形質膜細孔を作成します。

これにより、サイトカイン分泌と炎症性プログラム細胞死、パイロトーシスが起こり、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)を含む細胞内内容物が放出されます。LDH含有上清を採取します。

基質混合物(乳酸、ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、またはINT色素、NAD+、およびジアフォラーゼ)を追加します。LDHは乳酸をピルビン酸に酸化し、NAD+を還元します。ジアホラーゼはINTの還元を触媒し、赤色のホルマザンを形成します。

色の強度はLDHの放出に対応し、レベルが上昇すると、パイロトーシス関連の細胞損傷と死の増加を示します。

LDH放出アッセイを実行するには、10マイクロモルのニゲリシンを添加した50マイクロリットルのDMEM-5培地を各実験ウェルに加え、50マイクロリットルのDMEM-5を摂氏37度および5%二酸化炭素で60分間自発的および100%溶解対照ウェルに加えます。30分後、10マイクロリットルの10x溶解バッファーを100%溶解対照ウェルに加え、10マイクロリットルの培地を他のウェルに加えます。インキュベーションの最後にプレートを遠心分離し、各ウェルから50マイクロリットルの上清を透明な平底プレートに移します。

次に、解凍して調製したばかりの基質50マイクロリットルを各ウェルに加え、暗所で30分間インキュベートし、15分後にプレートをチェックして、シグナルがプレートリーダーの検出限界を超えないことを確認します。インキュベーションの最後に、各ウェルに50マイクロリットルの停止溶液を加え、適切なプレートリーダーでOD₄₉₀を測定して、ウェルあたりの細胞溶解の割合を計算できるようにします。