マクロファージにおけるCryptococcus neoformans感染を検出するための乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ

マクロファージを含むマルチウェルプレートを取ります。

クリプトコッカス・ネオフォルマンスをテストウェルに加え、コントロールウェルにはマクロファージのみが含まれます。

マクロファージはファゴソーム内の食作用真菌を食います。

緩衝液で洗浄して、非貪食菌を除去します。抗生物質を含まない培地を追加します。インキュベート。

ファゴソームはリソソームと融合し、ファゴリソソームを形成します。真菌はファゴリソソームのpHを調節し、過酷なファゴリソソーム条件を生き残るための固有のメカニズムを持っています。真菌は食利ソソーム膜を透過処理して複製し、多糖類で満たされた小胞の細胞質ゾルの蓄積を伴います。

細胞内真菌の滞留と複製は細胞損傷を引き起こし、細胞死経路を引き起こします。これにより、マクロファージの溶解と、乳酸デヒドロゲナーゼまたはLDHを含む細胞内内容物が培地に放出されます。

LDH含有培地を異なる時点で収集します。同様の時点でコントロールマクロファージを溶解し、細胞LDH放出を最大化します。アッセイ混合物を収集した培地および溶解物に加えます。LDHは乳酸をピルビン酸に変換し、NAD⁺を減少させます。ジアホラーゼはテトラゾリウム塩を還元し、赤いホルマザン生成物を形成します。

プレートリーダーを使用して、ホルマザン吸光度を測定し、クリプトコッカス・ネオフォルマンス感染後のマクロファージ溶解を定量化します。

マクロファージ感染用の真菌細胞を調製するには、中間対数期培養からC.ネオフォルマンス細胞を収集して遠心分離し、続いて同じ遠心分離条件下で1ミリリットルの室温PBSで3回穏やかに洗浄します。

最後の洗浄後、抗生物質を含まない細胞培養培地濃度の1.2倍10〜8分の10細胞/ミリリットルで真菌細胞を再懸濁し、70%〜80%コンフルエント6ウェルマクロファージ培養プレートの4ウェルのそれぞれに1ミリリットルの真菌細胞懸濁液を加える。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに3時間置きます。プレートを慎重に傾けて、各ウェルを洗浄ごとにウェルあたり1ミリリットルのPBSで3回穏やかに洗浄できるようにします。

最後の洗浄後の感染能力を測定するには、6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの抗生物質を含まない培地を加え、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。適切な実験時点で、各ウェルから上清を収集し、標準プロトコルに従って各ウェル内のLDHの量を測定します。同時に、感染していないマクロファージ細胞を溶解して、最大細胞毒性の値を決定します。

次に、細胞毒性は、示されている式を使用して計算できます。