細菌毒素の影響を研究するための透過性膜インサートベースの感染システム

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透過性メンブレンインサートで区切られた2室の感染システムを考えてみましょう。下部コンパートメントには、付着したヒトケラチノサイト、または皮膚細胞が含まれています。

上部チャンバーに細菌性病原体を加え、インキュベートします。膜は、病原体とケラチノサイトとの直接接触を防ぎます。病原体はストレプトリシンSまたはSLS(小さな毒素)を分泌し、膜を通過して細胞に到達します。

ケラチノサイトの重炭酸ナトリウム共輸送体は、重炭酸塩イオンとナトリウムイオンの流入を媒介し、細胞内pHを維持します。SLS は共輸送体に結合してイオン輸送を妨害し、細胞内浸透圧ストレスを引き起こします。

ストレス誘発性下流シグナル伝達は、隔離された核因子-カッパB(NF-κB)に結合した阻害剤の分解を引き起こし、その活性化につながります。活性化されたNF-κBは核に移動し、炎症誘発性サイトカイン産生のアップレギュレーションにつながります。

細胞外分泌時に、サイトカインは宿主細胞の死受容体に結合し、壊死を開始します。インキュベーション後、培養上清を回収して、細菌毒素の影響を評価します。

治療の直前に、1X PBSを使用して細胞を洗浄します。次に、薬理学的処理の有無にかかわらず、2ミリリットルの新鮮な増殖培地を6ウェルプレートに、または0.5ミリリットルの培地を24ウェルプレートのウェルに適用します。次に、層流フードの下で、滅菌鉗子を使用して、滅菌された0.4ミクロンの透過性メンブレンインサートを各ウェルに慎重に配置します。

感染準備中に透過性インサートを穏やかかつ無菌に取り扱うことは、このプロセス中に膜が損傷したり汚染されたりするのを防ぐために重要です。

製造元の指示に従って、新鮮な細胞培養培地を各ウェルの上部チャンバーに適用します。次に、適切な量の正規化された細菌培養物を透過性膜インサートシステムの上部チャンバーに適用し、細菌培地をコントロールウェルに適用します。

実験セットアップ中に細菌が下部チャンバーを汚染しないことが不可欠であるため、細菌を上部チャンバーに慎重に追加し、感染した細胞をインキュベーターに穏やかに輸送することが重要です。

分泌された宿主タンパク質を評価するには、滅菌鉗子を使用して透過性メンブレンインサートを慎重に取り外します。次に、細胞の単層を乱さずに、下部チャンバーから培地を1.5ミリリットルのチューブに集めます。

サンプルを14,000 RCF、摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞破片をペレット化します。次に、50マイクロリットルの上清を除くすべてを取り除き、新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏マイナス20度で保存するか、すぐに使用してください。

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Last updated: 18 July 2026