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性膜システムの下部コンパートメントに哺乳類の宿主細胞を播種することから始めます。
ストレプトリシンSまたはSLS毒素を分泌することが知られている病原菌である連鎖球菌をメンブレンインサートに追加します。SLS毒素は膜孔を通って拡散し、宿主細胞に到達します。
膜結合ナトリウム-重炭酸ナトリウム共輸送体はイオン輸送を調節し、細胞の恒常性を維持します。毒素はこれらの共輸送体に結合し、イオン輸送を妨害し、宿主細胞に浸透圧ストレスを引き起こします。
これにより、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路であるp38 MAPKを含むいくつかの下流シグナル伝達カスケードが活性化されます。活性化されたp38 MAPKは、その下流の標的をリン酸化し、細菌に対する細胞応答を開始します。
次に、透過性メンブレンインサートを取り外します。宿主細胞の上に培地を吸引します。溶解バッファーを加えて細胞内容物を放出します。遠心分離機で細胞破片をペレット化します。
可溶性ライセート成分を含む上清と不溶性ライセート成分を含むペレットを回収します。さらなる分析のためにサンプルを保管します。
治療の直前に、1X PBSを使用して細胞を洗浄します。次に、薬理学的処理の有無にかかわらず、2ミリリットルの新鮮な増殖培地を6ウェルプレートに、または0.5ミリリットルの培地を24ウェルプレートのウェルに適用します。次に、層流フードの下で、滅菌鉗子を使用して、滅菌された0.4ミクロンの透過性メンブレンインサートを各ウェルに慎重に配置します。
感染準備中に透過性インサートを穏やかかつ無菌に取り扱うことは、このプロセス中にメンブレンが損傷したり汚染されたりするのを防ぐために重要です。
製造元の指示に従って、新鮮な細胞培養培地を各ウェルの上部チャンバーに適用します。次に、適切な量の正規化された細菌培養物を透過性膜インサートシステムの上部チャンバーに適用し、細菌培地をコントロールウェルに適用します。
実験セットアップ中に細菌が下部チャンバーを汚染しないことが不可欠であるため、細菌を上部チャンバーに慎重に追加し、感染した細胞をインキュベーターに穏やかに輸送することが重要です。
滅菌鉗子を使用して、透過性メンブレンインサートを慎重に取り外します。
宿主細胞溶解物を評価するには、宿主細胞を乱すことなく、単層の上の培地を穏やかに吸引します。次に、PBSを使用して細胞を一度すすぎます。PBSを穏やかに吸引し、すぐに氷冷溶解バッファーを大量に塗布して、たとえば、1ミリリットルあたり0.5〜1.5ミリグラムのタンパク質濃度を達成します。次に、サンプルを氷上で15分間インキュベートします。
次に、セルスクレーパーを使用して各ウェルのプレート表面から細胞を切り離し、各ウェルの内容物全体を1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、サンプルを14,000 RCF、摂氏4度で20分間遠心分離します。
可溶性ライセート成分を評価するには、上清を新しいチューブに移し、摂氏マイナス20度で保存するか、すぐに使用してください。核またはその他の不溶性ライセート成分を評価するには、ペレットを予約し、摂氏マイナス20度で保存するか、すぐに使用してください。