蛍光イメージングによる宿主細胞への細菌付着の検出

細菌の付着に敏感な付着性上皮細胞単層を含むマルチウェルプレートを取ります。

さまざまな数の蛍光タンパク質タグ付き緑膿菌(病原性細菌)を添加して、目的の細菌と上皮細胞の比率を達成します。

遠

心分離機で細菌を上皮細胞に近づけ、相互作用を促進します。

細菌上のタンパク質繊維であるIV型線毛は、上皮細胞上の特定の糖脂質に結合し、宿主細胞への細菌の付着を媒介することにより極めて重要な役割を果たします。

インキュベーション後、緩衝液で洗浄して、非付着性細菌を除去します。細胞構造を維持するために細胞を固定します。

A-Tに富むDNA領域に強く結合し、核を染色する蛍光染色剤であるDAPIを加えます。細胞の乾燥を防ぐために、細胞を緩衝液で覆います。

DAPI染色核を持つ上皮細胞に付着したGFP標識細菌の画像を取得します。単一の上皮細胞上の付着細菌を列挙します。

用量依存的に宿主細胞あたりの付着細菌が増加すると、宿主と病原体の相互作用の定量化が可能になります。

細菌接着アッセイの場合は、各ウェルに100マイクロリットルの温かいPBSを加えて、以前に培養したA549細胞単層を3回洗浄し、穏やかに上下にピペットで移動します。次に、PBS を破棄します。または、PBSを追加した後、10秒間待ってから、真空を使用してPBSを除去します。

細菌会合の動態を決定するには、感染の多様性の異なる100マイクロリットルの所望の濃度の細菌懸濁液を細胞に重ねます。細菌をスピンダウンし、感染したA549細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%でさらに1時間インキュベートします。示されているように、単層を温かいPBSで5回洗浄することにより、結合していない細菌を除去します。

次に、氷上の96ウェルプレートのすべてのウェルに100マイクロリットルの4%ホルムアルデヒドを加えて細胞を固定します。15分後、プレートをPBSで3回洗浄して固定液を除去し、核を1ミリリットルあたり50ナノグラムのDAPI染色で室温で10分間染色します。

細胞をPBSで洗浄した後、感染したA549細胞を100マイクロリットルのPBSで覆い、乾燥を避けるため、プレートを摂氏4度で暗所で最大2日間保存するか、イメージングに進みます。