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細胞内カルシウムの蛍光指示薬をロードしたヒト上皮細胞の培養物を含むイメージングチャンバーを取ります。
カルシウムイオンを含む増殖培地を加えます。病原菌である赤痢菌を導入し、インキュベートします。
細菌の分泌系は宿主細胞に浸透し、侵入エフェクターを放出します。侵入はアクチン再構成を引き起こし、細菌の周囲に波立つ膜を形成します。
浸潤部位では、原形質膜上のホスホリパーゼC(PLC)が活性化され、イノシトール三リン酸受容体が小胞体または小胞体にクラスター
化します。
PLCは、膜ホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸をイノシトール三リン酸(IP3)に加水分解し、密なアクチン網目により局所的に蓄積します。
IP3は小胞体の受容体に結合し、カルシウムの放出を引き起こします。カルシウム指示薬は放出されたイオンに結合して蛍光を発し、局所的なカルシウム応答を示します。
IP3はアクチンを介してゆっくりと拡散し、ERカルシウムレベルをさらに枯渇させ、原形質膜カルシウムチャネルを活性化してカルシウム流入を引き起こします。
細胞全体の蛍光は、全体的なカルシウム応答の遅延を示します。
Fluo-4細胞を含むカバーガラスをイメージングチャンバーまたはガラス底チャンバーに入れます。EMバッファーを使用してサンプルを3回洗浄し、細胞溶解から生じる可能性のある化合物を除去します。次に、1ミリリットルのEMバッファーを追加します。チャンバーを摂氏33度に加熱した倒立蛍光顕微鏡ステージに置きます。顕微鏡フィールドを選択し、必要に応じて露光時間やビニングなどの取得パラメータを設定して、Fluo-4蛍光シグナルを最適化します。
サンプルに細菌を追加するには、チャンバーから500マイクロリットルのEMバッファーを慎重に取り除き、500マイクロリットルの細菌懸濁液を加えて、最終的なOD600を0.05にします。すぐに取得を実行するか、細菌が細胞に沈殿するまで10分間待ちます。取得ストリームの最後に、選択したフィールドの位相差画像を取得して、細胞に接触する細菌と細菌の侵入部位に関連する膜のフリルを視覚化します。
画像取得の期間、ファイルの保存、およびプロセス全体をカバーする新しいフィールドの選択に適した間隔で取得手順を繰り返します。取得手順の最後に、カルシウムイオノフォアイオノマイシンの2マイクロモルをサンプルに追加して、カルシウムシグナルの最大振幅を決定します。信号が安定するまで、通常は10分未満で、3〜5秒ごとに画像を取得します。
続いて、カルシウムキレート剤EGTAを最終濃度10ミリモルに添加して、カルシウムがない場合の蛍光シグナルを決定します。信号が安定するまで、通常は10分未満で、3〜5秒ごとに画像を取得します。テキストプロトコルに従って画像分析を実行します。