間葉系幹細胞によるマクロファージ食作用の制御を研究するためのアッセイ

間葉系幹細胞(MSC)を含むマルチウェルプレートを選択したウェルに取ります。

マクロファージを導入してインキュベートし、共培養ウェルでのMSC-マクロファージ相互作用を促進します。

pH感受性蛍光色素に結合したザイモサン(酵母細胞壁成分)をすべてのウェルに追加します。

マクロファージスカベンジャー受容体はザイモサンに結合し、ファゴソーム内でのその飲み込みを引き起こし、ファゴソームはリソソームと融合してファゴリソソームを形成します。

ファゴリソソーム内の酸性pHにより、蛍光色素は蛍

光を発します。

共培養ウェルでは、MSCはマクロファージと架橋するトンネルナノチューブ(TNT)の細胞質延長を投影します。MSCミトコンドリアはTNTを通ってマクロファージに入り、機能的なミトコンドリアの総数を増加させます。

ミトコンドリア数の増加は、アデノシン三リン酸またはATPの産生を増強し、食作用の増加のためのエネルギー要件を促進します。

内在化された蛍光色素結合ザイモサンからの経時的な蛍光強度を記録します。

共培養は、マクロファージのみのウェルと比較して蛍光の増加を示し、MSCを介したマクロファージ食作用の増強を示しています。

間葉系幹細胞を含む実験ウェルから培地を穏やかに吸引します。マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、プレート設計に従って100マイクロリットルの処理済みマクロファージ細胞懸濁液と対照マクロファージ細胞懸濁液を適切な実験ウェルに加え、実証済みのように一晩インキュベートします。1ミリグラムのザイモサン粒子を含むバイアルに1ミリリットルの生細胞イメージング培地を加え、培地粒子混合物をガラス培養チューブに集めます。

バイアルをさらに1ミリリットルのイメージング溶液ですすぎた後、すすぎたイメージングメディアをガラス管に移します。次に、3ミリリットルの追加イメージング溶液を加えて、0.2 mg/mlのザイモサン粒子懸濁液を達成します。クイックパルスを使用してザイモサン懸濁液を30〜60秒間渦巻きします。次に、プローブ超音波処理器を使用して、60回のクイックパルスで懸濁液を超音波処理します。培地を吸引した後、試薬ブランクウェル内の実験ウェルを100マイクロリットルの生細胞イメージング溶液ですすいでください。

次に、ウェルから生細胞イメージング溶液を吸引し、100マイクロリットルのザイモサン懸濁液を加えます。タッチパッドインターフェースを使用して、蛍光リーダーのプレートトレイを開きます。蓋のないプレートを、左上隅のA1ウェルのあるトレイにセットします。タッチパッドを使用してトレイを閉じ、トップメニューの緑色の「読み取り」ボタンをクリックします。