ヒト血清の殺菌活性に対する細菌耐性におけるビトロネクチンの役割の決定

ヒト血清糖タンパク質であるビトロネクチンが細菌に及ぼす影響を調べるには、まずインフルエンザ菌懸濁液を含むチューブから始めます。

一方のチューブをビトロネクチンを含む正常なヒト血清で処理し、もう一方のチューブをビトロネクチン枯渇血清で処理します。どちらの血清バリアントにも、殺菌活性に不可欠な抗体とさまざまな補体タンパク質が含まれています。

インキュベーション中、抗体は細菌の表面タンパク質と相互作用し、補体タンパク質を活性化して C5 コンバーターゼを形成し、C5 を切断します。C5bはC6と結合し、続いてC7と結合し、C5b6-7複合体を形成します。この複合体は細菌の細胞膜に結合してC8を動員し、C5b67-8を形成します。

このプロセスにより、C9モノマーの付着とその重合が促進され、膜攻撃複合体(細孔形成構造)が生成されます。これらの細孔はイオンと水の流入を引き起こし、細菌の溶解を引き起こします。

対照的に、正常な血清を含むチューブでは、ビトロネクチンは、C5b6-7複合体およびC9モノマーと相互作用する細菌表面タンパク質に結合します。これらの相互作用は、C8の動員とC9の重合を防ぎ、膜攻撃複合体の形成を阻害し、細菌の生存につながります。

チューブと個々の寒天プレート上の培養の両方から細菌懸濁液を取り出します。

ビトロネクチンを含む血清中の高位細菌コロニーはヒト血清の殺菌活性に対する細菌耐性におけるその役割を確認する

ヒト血清の殺菌活性に対するビトロネクチン依存性耐性の分析を実行するには、まず、テキストプロトコルに記載されているように細菌を培養し、ペレット化します。遠心分離後、細菌ペレットを1容量のデキストロースゼラチンベロナルバッファーで再懸濁します。次に、1,500%血清を含む100マイクロリットルのDGVB++に5CFUの細菌を追加します。

サンプルを摂氏37度で15分間インキュベートし、300RPMで振とうします。0分と15分で反応混合物から10マイクロリットルのアリコートを取り除きます。アリコートをチョコレート寒天培地に置き、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。チョコレート寒天プレートをインキュベートした後、プレート上に現れるコロニーを数え、テキストプロトコルに記載されているように死滅した細菌の割合を計算します。