IgGオプソニン化赤血球のマクロファージ食作用のリアルタイムイメージング

マウスマクロファージを含むチャンネルスライドを取ります。このチャネルは培地で満たされたリザーバーに接続し、マクロファージに栄養素を供給します。

培地を、特定の表面糖タンパク質に結合してマクロファージを標識する培地を含む蛍光タグ付き抗体に置き換えます。

蛍光標識された細胞膜を持つヒト赤血球、赤血球を取ります。グリコホリンAに特異的に結合するマウスIgG抗体で赤血球をオプソニン化します。

IgGオプソニン化赤血球をマクロファージ含有スライドに加えます。マクロファージFc受容体は、赤血球上のIgGのFc領域に結合し、その結果、接触領域の周囲にFc受容体がクラスター化され、食作用のために赤血球をマークします。

結合は細胞内シグナル伝達経路を誘発し、GTPaseを活性化します。活性化されたGTPアーゼはアクチンの再編成と重合を促進し、糸状偽足と呼ばれる薄い膜突起を形成します。

さらに、糸状偽足は赤血球の周囲に広がり、発達中の食細胞カップ内に赤血球を囲みます。カップの端が融合し、分解のためにオプソニン化された赤血球を内在化するファゴソームを形成します。

共焦点顕微鏡を使用して、単一の食作用イベントのタイムラプス画像を取得します。

腹膜マクロファージを標識するには、各チャネルスライドの重炭酸培地をHEPESを添加した完全培地に置き換え、スライドを傾けて、100マイクロリットルの蛍光タグ付きマウスマクロファージ特異的抗体をスライドの100マイクロリットルチャネルの開口部に滴下するようにします。下流のリザーバーに流入する培地を吸引し、二酸化炭素のない状態で摂氏37度の湿ったチャンバーで細胞を20分間インキュベートします。

腹膜細胞が標識されている間に、4〜2,000の赤血球サンプルを穏やかに混合し、400マイクロリットルの細胞を層流フード内の加熱されたアルミニウムブロック内の新しい2ミリリットルの微量遠心チューブに約5〜8分間移します。

細胞が摂氏37度に温まったら、0.4マイクロリットルの適切な赤色蛍光原形質膜染色剤を細胞と混合し、細胞をヒートブロックに戻します。5分後、1.6ミリリットルの新鮮なHEPESを添加した完全培地と遠心分離機を加えて細胞を洗浄します。チューブを回転させて赤血球ペレットを識別します。

1〜1.5ミリリットルのピペットチップを使用して、ペレットを乱さずに上清を2容量に分けて慎重に除去します。次に、2,000マイクロリットルの新鮮なHEPESを添加した完全培地を細胞と混合します。ペレットを遠心分離し、400マイクロリットルの培地に再懸濁します。次に、チューブに原形質膜染色のPMSにラベルを付けます。20分間の腹膜細胞標識インキュベーションの最後に、スライドを1ミリリットルの新鮮な完全HEPES添加培地で洗浄します。

赤血球をオプソニン化するには、1マイクロリットルのマウスIgG2bモノクローナル抗ヒトCD235a抗体をPMSサンプルチューブに加えます。摂氏37度で8分間、1分に1回混合した後、100マイクロリットルの原形質膜染色、IgGオプソニン化ヒト赤血球を腹膜マクロファージ含有チャネルスライドに移します。ヒト赤血球が添加されたらすぐに、ステージインキュベーターを摂氏37度に設定した状態でスピニングディスク共焦点顕微鏡にスライドを取り付け、すぐに細胞のイメージングを開始します。