0 閲覧数 • 2:53 分 • July 8th, 2025
まず、アッセイ中の血清エステラーゼ干渉を最小限に抑えるために、無血清培地にがん細胞を含むチューブを取ります。非蛍光カルセインAM色素でインキュベートします。
活性細胞内エステラーゼはカルセインAMを細胞質に保持された膜不透過性蛍光カルセイン色素に加水分解
する カルセイン染色がん細胞とエフェクターNK細胞をテストウェルにプレートしますが、コントロールウェルにはNK細胞のないカルセイン染色がん細胞のみが含まれます。
NK細胞の活性化細胞表面受容体は、がん細胞上の活性化リガンドに結合し、免疫シナプスを形成します。この結合によりNK細胞シグナル伝達が活性化され、パーフォリンとグランザイムを含む細胞傷害性顆粒がシナプスに向かって分極して放出されます。
パーフォリンはがん細胞膜の細孔を形成し、グランザイムの細胞侵入を促進し、アポトーシスを開始します。膜の完全性が損なわれると、蛍光カルセイン漏出が発生し、がん細胞の蛍光が低下します。
ウェルの蛍光画像をキャプチャします。
対照ウェルよりもNK細胞含有ウェルの蛍光生がん細胞数が減少していることは、がん細胞に対するNK細胞媒介性細胞毒性を示しています。
カルシウムAMを使用してNK細胞媒介性細胞毒性を評価するには、実証されているように、ヒト肝がん細胞株細胞を70%から80%のコンフルエントに増殖させた後、細胞を3ミリリットルの無血清DMEMに再懸濁し、1.5マイクロリットルの10ミリモルカルシウムAM溶液で細胞を室温で30分間標識します。インキュベーションの最後に、遠心分離によって細胞を収集し、洗浄ごとに5ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。
細胞を培地濃度1ミリリットルあたり1 x 105細胞で再懸濁し、100マイクロリットルの細胞を96ウェルプレートの各ウェルに処理条件ごとに3回加えます。次に、100マイクロリットルの培地に1 x 105ヒトNK細胞を標的細胞の各ウェルに加え、プレートを細胞培養インキュベーターに4時間置きます。
インキュベーション終了後、蛍光顕微鏡で各処理条件の反復ごとに、カルシウムAM陽性細胞の少なくとも10の異なる画像フィールドを蛍光顕微鏡で10倍の倍率でキャプチャします。次に、式を使用して細胞毒性の割合を計算します。