走化性刺激に応答したナチュラルキラー細胞の移動の測定

ケモカインなどの化学誘引物質をマルチウェルプレートに添加します。

適切な細孔サイズのトランスウェル透過性チャンバーをウェルに入れます。ナチュラルキラー(NK)細胞懸濁液を上部チャンバーに加え、インキュベートします。

少数のケモカイン分子が膜を通って拡散し、NK細胞受容体に結合します。これにより、細胞骨格の変化を促進するシグナル伝達経路が引き起こされ、その結果、下部チャンバー内の化学誘引物質濃度が高い方向性に向かって細胞が移動します。

インキュベーション後、一定量の移動した細胞を下部チャンバーから蛍光活性化細胞選別またはFACSチューブに移します。所定の数の蛍光計数ビーズを追加し、FACSベースの細胞計数を実行します。

次の式を使用して、サンプル中の移動したNK細胞の絶対数を決定します。

ドットプロットは、蛍光と散乱の特性に基づいて、異なる領域として分離されたカウントビーズと細胞の数を示します。

走化性刺激に応答したNK細胞遊走を測定するには、70%〜80%コンフルエント培養からヒトNK細胞を回収し、無血清NK細胞培養培地濃度の1ミリリットルあたり2.5 x 10⁶細胞で細胞を再懸濁します。次に、ウェルあたり600マイクロリットルの目的のNK細胞化学誘引物質を含む無血清培地を追加します。

そして、5マイクロメートルの細孔を持つ直径6.5ミリメートルの培養インサートを1つ培地の各ウェルに入れます。次に、100マイクロリットルのNK細胞を各インサートの上部コンパートメントに加え、プレートを細胞培養インキュベーターに4時間置きます。

インキュベーションの最後に、接着していない移動細胞の全量を各ウェルの底から個々の5ミリリットルのFACSチューブに移し、所定の数のフローサイトメトリーカウンティングビーズを15マイクロリットル各チューブに加えます。次に、フローサイトメーターを使用して、標準的なフローサイトメトリー分析プロトコルに従って各細胞サンプルを評価し、式を使用して移動したNK細胞の絶対数を計算します。