腹膜マクロファージによるアポトーシス性胸腺細胞のエフェロサイトーシスの解析

エフェロサイトーシスは、食細胞がアポトーシス細胞を除去するプロセスです。

エフェロサイトーシスを分析するには、アポトーシス感受性マウス胸腺細胞を取得します。細胞透過性CFSE色素でインキュベートします。

細胞内エステラーゼはCFSEを細胞不透過性蛍光色素に切断し、胸腺細胞を染色する。過剰な汚れを防ぐために、熱不活化セラムを追加します。

染色した胸腺細胞を培養プレートにプレートします。プロテインキナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンを加えると、重要な細胞シグナル伝達カスケードが破壊され、アポトーシスが誘導されます。さらに、ホスファチジルセリン残基は細胞膜の外側の小葉に移動し、「イートミーシグナル」として機能します。

特異的受容体チロシンキナーゼを発現する活性化されたマウス腹膜マクロファージを含むマルチウェルプレートウェルに、増加するアポトーシス胸腺細胞濃度を追加します。

これらのキナーゼは、露出したホスファチジルセリンをアポトーシス胸腺細胞に結合し、マクロファージによる胸腺細胞の内在化を促進します。

インキュベーション後、自由浮遊アポトーシス胸腺細胞を除去します。マクロファージCD11b分子に結合する蛍光色素タグ付き抗CD11b抗体を追加します。

蛍光顕微鏡を使用して、異なる蛍光マクロファージ内の蛍光アポトーシス胸腺細胞を観察し、エフェロサイトーシスを示します。

アポトーシス胸腺細胞濃度が高いウェルは、内在化された胸腺細胞の増加を示します。

ナイーブC57 / Black-6マウスの胸腔を開いた後に胸腺細胞を採取するには、湾曲した細い先端鉗子を使用して胸腺を引き抜きます。臓器を10ミリリットルのRPMI-1640培地を含む組織培養皿に入れます。胸腺全体を2枚の顕微鏡スライドのつや消し端に押し付け、得られた組織懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにろ過します。遠心分離によって胸腺細胞を収集し、ペレットを40ミリリットルに再懸濁します。

カウント後、細胞を再度遠心分離し、50ミリリットルチューブあたり20ミリリットルの新鮮なPBSに最大2 x 10⁸細胞を再懸濁します。チューブあたり20ミリリットルのPBSに5マイクロモルのCFSEで細胞を標識します。チューブを2〜3回反転させて混合し、胸腺細胞を光から保護して室温で2分以内にインキュベートします。インキュベーションの最後に、10ミリリットルの熱不活化馬血清で反応を停止し、遠心分離によって細胞を収集します。

標識細胞を40ミリリットルの新鮮なPBSに再懸濁して計数および遠心分離し、続いて40ミリリットルの培地でさらに洗浄します。培地洗浄後、胸腺細胞を組織培養培地濃度1ミリリットルあたり7 x 10⁶細胞で再懸濁し、細胞を100ミリメートルの組織培養皿に播種します。次に、スタウロスポリンを1マイクロモルの最終濃度で細胞培養物に添加し、プレートを組織培養インキュベーターに4時間置きます。

腹膜マクロファージ単離のために、2匹のC57 / Black-6マウスに1ミリリットルの3%老化チオグリコール酸を0日目に腹腔内に注射し、5日目に腹膜を乱すことなく腹部皮膚を開きます。

腹腔を洗い流すには、18ゲージの針を備えた10ミリリットルのシリンジを使用して、10ミリリットルの洗浄バッファーを空洞にすばやく押し込んでから、洗浄バッファーをゆっくりと吸引して50ミリリットルのチューブに収集します。腹膜強制経口をPBSで2回洗浄します。腹膜マクロファージを組織培養培地濃度1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の2倍で再懸濁します。

次に、500マイクロリットルのマクロファージを24ウェルプレートの各ウェルに播種し、プレートを組織培養インキュベーターに2時間置きます。インキュベーションの最後に、上清を吸引して浮遊細胞を除去し、各ウェルに500マイクロリットルの組織培養培地を加えます。

培養物の各ウェルに500マイクロリットルの培地中の0〜12 x 10⁶胸腺細胞をすぐに添加し、プレートを組織培養インキュベーターに4時間置きます。インキュベーションの最後に、各ウェルを新鮮なPBSで2回洗浄して、自由浮遊アポトーシス細胞を除去し、続いて染色バッファーで1回洗浄します。次に、プレート結合マクロファージをウェルあたり適切な抗CD11b抗体を添加した200マイクロリットルの染色バッファーで標識し、プレートを摂氏4度で20分間置きます。