マクロファージ細胞外トラップのin vitro刺激と可視化

付着性マクロファージ培養から始めます。

炎症誘発性サイトカインを追加します。

サイトカインはマクロファージ表面受容体に結合し、一連の炎症事象を開始します。

まず、サイトカインシグナル伝達が抗菌ペプチドの産生を引き起こします。

同時に、マクロファージ核内のクロマチンは縮縮解除を受けます。

このプロセスは、膜組成の変化と相まって、核膜を破壊し、縮合解除されたクロマチンを細胞質に放出します。

細胞質では、抗菌ペプチドは放出されたクロマチンと相互作用します。

サイトカインシグナル伝達を介した細胞膜透過処理により、脱凝縮したクロマチンが細胞外空間に放出され、マクロファージ細胞外トラップ(MET)が形成されます。

これらのウェブ状の構造は、DNA、ヒストン、抗菌分子、酵素で構成されています。

細胞外トラップで露出したDNAに選択的に結合する蛍光核酸色素であるSYTOXグリーンを追加します。

蛍光顕微鏡下では、METは刺激されたマクロファージから放出された細胞外DNAの緑色の縞として現れます。

無

菌条件下で、完全なRPMI 1640培地へのMET放出の異なる刺激因子を含む培地を調製します。次亜塩素酸刺激の実験では、摂氏 37 度に予熱された HBSS を含むファルコン チューブに 200 マイクロモルの次亜塩素酸を調製します。

分極処理後、各ウェルから細胞培地を吸引し、PMA、TNF-α、およびインターロイキン-8刺激用の滅菌PBS、または次亜塩素酸刺激用のHBSSのいずれかの1ミリリットルのアリコートで細胞を3回注意深く洗浄します。

最終洗浄ステップでPBSを除去した後、PMA、TNF-α、またはインターロイキン-8を含む完全培地1ミリリットルを加えます。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で細胞インキュベーターで6時間インキュベートし、TNF-α刺激の場合は6時間、PMAまたはインターロイキン-8刺激の場合は24時間インキュベートします。

次亜塩素酸を用いた実験では、最終洗浄工程でHBSSを除去した後、調製したばかりの次亜塩素酸1ミリリットルを加える。次に、細胞インキュベーター内で5%の二酸化炭素の存在下で、摂氏37度で細胞を15分間インキュベートします。その後、細胞上清を注意深く吸引し、HBSSの1ミリリットルのアリコートで細胞を3回洗浄します。

最終洗浄ステップからHBSSを除去した後、1ミリリットルの完全RPMI 1640培地を加えます。次に、細胞インキュベーターで5%の二酸化炭素の存在下で摂氏37度で細胞を24時間インキュベートします。

HBSS中で40マイクロモルの濃度でSYTOXグリーン色素を調製します。HMDMを含む各ウェルに25マイクロリットルの色素を直接加えます。細胞を室温で暗所で5分間インキュベートします。次に、HMDMを倒立蛍光顕微鏡の顕微鏡ステージ