0 閲覧数 • 3:35 分 • July 8th, 2025
毒性のある黄色ブドウ球菌株と毒性の低い黄色ブドウ球菌株を取ります。
細菌をオプソニン化するために血清を加えます。
増加する細菌濃度を好中球を含む冷却マルチウェルプレートウェルに移します。低温は好中球の活性化を妨げます。
同期食作用を促進するための遠心分離機。
好中球受容体はオプソニンに結合し、ファゴソームへの細菌の内在化を引き起こします。
毒性細菌では、食体環境が細胞溶解性毒素の発現を引き起こします。
これらの毒素は細孔を形成し、ファゴソームを破壊し、好中球膜の完全性を損
ないます。ただし、毒性の低い細菌は細胞溶解性毒素の発現の低下を示します。
インキュベーション後、好中球を分離し、蛍光ヨウ化プロピジウム(PI)色素を含むフローサイトメーターチューブに移します。
色素は膜が損傷した好中球に入り、DNAを染色します。
フローサイトメーターを使用して、PI染色のために好中球を分析します。
毒性の低い株と比較して、毒性株の食作用後のPI陽性好中球の割合の濃度依存性の増加は、好中球に対する毒性株の細胞毒性を示しています。
継代培養した黄色ブドウ球菌が指数関数的に半ばに成長したら、培養菌1ミリリットルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、室温で5000gで5分間遠心分離します。ペレットを乱すことなく上清を吸引して黄色ブドウ球菌を洗浄し、ペレット化された細菌を1ミリリットルのDPBSに再懸濁します。サンプルを30秒間渦巻きます。サンプルを室温で5000gで5分間遠心分離します。
黄色ブドウ球菌をオプソニン化するには、まず、細菌ペレットを1ミリリットルの20%ヒト血清に再懸濁します。次に、サンプルを摂氏37度で15分間攪拌しながらインキュベートします。前述のように、遠心分離後にオプソニン化黄色ブドウ球菌を洗浄します。オプソニン化黄色ブドウ球菌株を1 x 10 8コロニー形成単位、CFU/ミリリットルに、氷冷RPMIで希釈します。サンプルを30秒間渦巻き、氷の上に置きます。
これらのアッセイに用いる黄色ブドウ球菌の濃度は、寒天に1〜10回の連続希釈液をプレーティングすることにより確認します。ステップ1.14の氷上の96ウェルプレートで、ポジティブおよびネガティブコントロールの各黄色ブドウ球菌株(RPMI)のウェルあたり100マイクロリットルをPMNにそっと加えます。プレートをそっと揺らして、黄色ブドウ球菌を井戸に分配します。
プレートを摂氏4度で8分間500 gで遠心分離し、遠心分離直後に時間0としてプレートを摂氏37度でインキュベートすることにより、食作用を同期させます。目的の時点で、プレートを氷の上に置き、1マイクロリットルのヨウ化プロピジウムを含む200マイクロリットルの氷冷DPBSを各フローサイトメトリーチューブに加え、サンプルを対応するチューブに移します。