JoVE 実験百科事典
免疫学
0 回視聴 • 5:26 分 • July 8th, 2025
結核菌を含むエアロゾル液滴にマウスをさらします。
細菌は、マクロファージを含む肺胞(肺内の小さな気嚢)の内腔に到達します。
マクロファージパターン認識受容体は、細菌の病原体関連分子パターンに結合し、ファゴソームへの飲み込みを引き起こします。
飲み込まれた細菌は特殊なタンパク質を分泌し、ファゴソーム膜を破裂させます。細菌は細胞質に逃げて繁殖します。
感染後、マウスを麻酔します。レポーター酵素蛍光またはREFイメージングのために、細菌β-ラクタマーゼ酵素のレポーター基質を腹腔内に投与します。
基質は循環を介して肺胞に到達し、感染した細胞に入ります。
細菌の外膜を貫通して、β-ラクタマーゼを含むペリプラズム空間に到達します。
基板には、蛍光色素とクエンチャーを接続するβ-ラクタム環が含まれています。近接しているため、蛍光色素の蛍光はクエンチャーに吸収されます。
β-ラクタマーゼはβ-ラクタム環を加水分解し、蛍光色素を放出し、蛍光発出をもたらします。
蛍光を画像化して、抗酸菌感染を評価します。
続行するには、既知の体重の動物を電源を入れた接種チャンバーにロードします。チャンバーには最大90匹のマウスを収容できます。次に、ドアのすべてのラッチを閉めます。次に、スチール製クランプを使用してネブライザーを接続します。次に、チャンバーのスタートボタンを押し、風量を毎分3〜5リットルに設定します。
圧縮空気は1平方インチあたり約22〜26ポンドで流れ、重要なことに、チャンバー内で接種物のミストを見ることができるはずです。15分後、コントロールパネルの前面に赤いライトが表示され、可聴信号が走行の終了を示します。次に、リセットボタンを押してタイマーをリセットします。真空を解除するには、チャンバーのドアにある小さな赤いボタンを押します。
次に、チャンバーのドアを開けて、マウスをホームケージに戻します。今後は、動物を収容室に保管してください。次に、輸送容器内の瓶をバイオセーフティキャビネットに戻します。そこで、残りの細菌懸濁液を指定された廃棄物容器に捨てます。次に、使用済みのネブライザージャーをバイオハザードバッグに入れ、オートクレーブに輸送するためにバッグを密封します。
チャンバーを洗浄するには、緩衝フェノールと70%エタノールを内面にスプレーします。これらの溶液をそれらの表面に10分間反応させてから、完全に拭き取ります。すべてのワイプはバイオハザードゴミ箱に捨ててください。次に、ゴミ、廃棄物容器、使用済みのネブライザージャーをオートクレーブします。
動物をイメージングルームに移します。そこで、テキストプロトコルに従って動物を麻酔し、腹腔内注射によって造影剤を注射します。イメージングシステムソフトウェアで、システムを初期化し、温度バーが緑色に変わったら続行します。システムを初期化した後、マウスをイメージングチャンバーに入れます。
鼻孔が鼻錐内にあることを確認して、画像検査中に麻酔薬が投与されるようにしてください。次に、コンピューターに戻ります。取得コントロールパネルで、蛍光、透過照明(動物全体の視覚化)、または落射照明を選択して肺組織を表示します。マウス 1 本の場合は、視野を B に設定し、ランプ レベルを高に設定します。
露出には、自動時間、中ビニング、F/ストップに2つまたは3つを使用します。次に、励起フィルターを745ナノメートルに、発光フィルターを780〜840ナノメートルに設定します。次に、シーケンスのセットアップに移動し、関心のある領域で9〜12の透過照明ポイントを選択します。次に、取得ボタンを押して画像を収集します。